一种用于大片段DNA组装的基因工程酵母菌、构建方法及其应用与流程

本发明涉及分子生物学及合成生物学，具体涉及一种用于大片段dna组装的基因工程酵母菌、构建方法及其应用。

背景技术：

1、随着合成生物学的发展，人工合成、设计改造的尺度越来越大，由以往的基因片段、单个代谢途径向多个代谢途径乃至完整基因组拓展。随着研究需求的发展，dna组装技术面临着越来越大的挑战。近年来，dna组装技术不断发展，小片段dna组装技术已经相对成熟稳定。小片段dna组装多采用体外酶法组装，如依赖于高保真聚合酶的重叠延伸pcr法(oe-pcr)、依赖于内切酶和连接酶的golden gate法、依赖于核酸外切酶、连接酶和dna聚合酶协同作用的等温同源重组法(gibson)等。但大片段dna由于分子量大、易断裂、易形成二级结构，使得体外组装的效率低下且易发生碱基变异，因此大片段dna主要利用微生物细胞的重组能力进行体内重组。常见的体内组装宿主主要是大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母等模式生物，其中酿酒酵母因其承载力高、同源重组效率高，已是大片段dna组装的第一选择。研究表明，dna片段的长度、数量、重组臂大小等因素与组装成功率显著负相关，目前常规的酿酒酵母已无法满足dna合成领域日益增长的需求。如何进一步提高酿酒酵母体内组装的效率及dna尺寸是目前亟待解决的问题。

2、酿酒酵母体内存在非同源连接(non-homologous end joining，nhej)及同源重组(homologous recombination，hr)两种线性dna组装模式。其中，同源重组过程决定了转入dna片段最终组装构建的完整性和保真度，是大片段dna体内组装的关键过程。但通过基因编辑手段，在酿酒酵母中进一步提高大片段dna组装能力的专利未见报道。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于大片段dna组装的基因工程酵母菌，经过改造后的基因工程酵母菌可作为大片段dna的组装平台，广泛且高效地组装大片段dna。

2、为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：

3、本发明提供了一种用于大片段dna组装的基因工程酵母菌，所述基因工程酵母菌是以酿酒酵母为原始菌株经基因编辑得到；所述基因编辑包括如下任意一种：1)敲除ku基因；2)敲除ku基因并在敲除位点插入scrad52-m基因表达框；3)敲除ku基因并过表达scrad52基因。

4、优选的，所述酿酒酵母包括但不限于酿酒酵母by4741；所述ku基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

5、优选的，所述scrad52-m基因表达框包含gap启动子、scrad52-m基因和adh1终止子；所述gap启动子、scrad52-m基因、adh1终止子及scrad52-m基因表达框的核苷酸序列分别如seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4及seq id no.5所示。

6、优选的，所述过表达scrad52基因具体为：

7、在所述酿酒酵母基因组scrad52基因前插入gap启动子；所述gap启动子的核苷酸序列如seq id no.2所示。

8、本发明还提供了上述基因工程酵母菌的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：

9、以酿酒酵母为原始菌株，通过crispr/cas9系统敲除基因组上的ku基因，得到基因工程酵母菌株synbio-sc1；

10、在基因工程酵母菌株synbio-sc1的基础上，通过crispr/cas9系统将scrad52-m基因表达框整合到基因工程酵母菌株synbio-sc1中的敲除位点，得到基因工程酵母菌株synbio-sc2；

11、在基因工程酵母菌株synbio-sc1的基础上，通过crispr/cas9系统将gap启动子整合到基因工程酵母菌株synbio-sc1中scrad52基因前，得到基因工程酵母菌株synbio-sc3。

12、优选的，通过如下步骤敲除基因组上的ku基因：

13、分别构建puc57-donor-ku70质粒和pcas9-sgrna-ku70质粒，将从puc57-donor-ku70质粒中回收得到的donor-ku70线性dna片段和pcas9-sgrna-ku70质粒共同转化至酿酒酵母by4741，经离心、孵育、培养后进行pcr筛选克隆，即可得到基因工程酵母菌株synbio-sc1。

14、优选的，所述puc57-donor-ku70质粒是由donor-ku70基因片段组装至puc57-kan载体上所得；所述donor-ku70基因片段的核苷酸序列seq id no.6所示；

15、所述pcas9-sgrna-ku70质粒是由sgrna-ku70基因片段组装至cripsr载体上所得；所述sgrna-ku70基因片段的核苷酸序列seq id no.7所示。

16、优选的，通过如下步骤将scrad52-m基因表达框整合到基因工程酵母菌株synbio-sc1中的敲除位点：

17、分别构建puc57-donor-rad52质粒和pcas9-sgrna-ku70质粒，将从puc57-donor-rad52质粒中回收得到的donor-rad52线性dna片段和pcas9-sgrna-ku70质粒共同转化至酿酒酵母by4741，经离心、孵育、培养后进行pcr筛选克隆，即可得到基因工程酵母菌株synbio-sc2；

18、所述puc57-donor-rad52质粒是由donor-rad52基因片段组装至puc57-kan载体上所得；所述donor-rad52基因片段的核苷酸序列seq id no.8所示。

19、优选的，通过如下步骤将gap启动子整合到基因工程酵母菌株synbio-sc1中scrad52基因前：

20、分别构建puc57-donor-pgap质粒和pcas9-sgrna-rad52质粒，将从puc57-donor-pgap质粒中回收得到的donor-pgap线性dna片段和pcas9-sgrna-rad52质粒共同转化至基因工程酵母菌株synbio-sc1，经离心、孵育、培养后进行pcr筛选克隆，即可得到基因工程酵母菌株synbio-sc3；

21、所述puc57-donor-pgap质粒是由donor-pgap基因片段组装至puc57-kan载体上所得；所述donor-pgap基因片段的核苷酸序列seq id no.9所示；

22、所述pcas9-sgrna-rad52质粒是由sgrna-rad52基因片段组装至cripsr载体上所得；所述sgrna-rad52基因片段的核苷酸序列seq id no.10所示。

23、本发明还提供了上述的基因工程酵母菌或上述的构建方法在大片段dna高效组装中的应用。

24、本发明的有益效果：

25、本发明通过crispr/cas9方法对酿酒酵母基因组进行改造，获得了三种大片段dna高效组装基因工程酵母菌synbio-sc1、synbio-sc2和synbio-sc3。经试验证实，本发明的基因工程酵母菌能够高效组装高达60kb的大片段dna，组装效率高达63.5％～93.8％。本发明极大的提升了大片段dna的组装效率和合成上限，同时也可降低生产成本，对于基因合成与合成生物学构建的工业研究与生产具有重要意义。