技术特征：
1.一种抑制番茄果实成熟的基因slwrky71，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如seq no.1所示。2.一种抑制番茄果实成熟的调控方法，其特征在于：包括下列步骤：步骤1：将靶点一正向引物-f1、靶点一反向引物-r1、靶点二正向引物-f2和靶点二反向引物-r2用无菌ddh2o混合稀释至浓度为1μm，然后置于pcr仪中，88-92℃条件下处理25-35 s，然后移至室温冷却，完成靶点引物退火，得到靶点接头引物混合物；靶点一正向引物-f1：5
’‑
gtcacaatggcagcagccaagaaa-3’；靶点一反向引物-r1：5
’‑
aaactttcttggctgctgccattg-3’；靶点二正向引物-f2：5
’‑
gtcaggatgcactactccctctct-3’；靶点二反向引物-r2：5
’‑
aaacagagagggagtagtgcatcc-3’；步骤2：配制包含步骤1中靶点接头引物混合物的酶切连接反应液，利用边切边连法，使靶点接头与grna表达盒连接，扩增grna表达盒；步骤3：以步骤2得到的产物为模板，进行第一轮pcr扩增；步骤4：以步骤3得到的第一轮pcr扩增产物为模板，进行第二轮pcr扩增，扩增完成后估测产物浓度；步骤5：把步骤4得到的2个二轮pcr产物等量混合，用dna产物纯化试剂盒纯化后取2 μl纯化产物进行琼脂糖凝胶电泳，检查产物纯化效果，浓度不低于5ng/μl即可进行下一步；步骤6：利用边切边连法进行grna表达盒与cas9质粒的连接；步骤7：连接完成后取步骤6连接产物通过化学热激法转化大肠杆菌dh5α，提取质粒，测序检测；步骤8：将crispr/cas9-slwrky71质粒转化eha105农杆菌感受态细胞；步骤9：将含有crispr/cas9-slwrky71质粒的eha105农杆菌侵染番茄子叶并获得转基因阳性苗wrky71；步骤10：以番茄cdna为模板，根据mrna的序列分别设计两轮引物；第一轮引物无酶切位点，第二轮的上游引物需从起始密码子或起始密码子前面几个碱基开始，下游引物必须从终止密码子开始，二轮引物需引入酶切位点；以上游引物-f和下游引物-r进行pcr扩增，pcr扩增产物纯化后，得到目的基因片段；第一轮正向引物-f1：5
’‑
atgggtgatgaactaagagatttg-3’；第一轮反向引物-r1：5
’‑ꢀ
tcatggttcttgtttaagattaaa-3’；第二轮正向引物-f2：5
’‑ꢀ
gagaacacgggggactctagaatgggtgatgaactaagagatttgtact-3’；第二轮反向引物-r2：5
’‑ꢀ
cttgtaatcggtaccctcgagtggttcttgtttaagattaaacatagaagg-3’；步骤11：用限制性内切酶bamhi和限制性内切酶xhoi对载体pbi121进行双酶切，酶切产物纯化后，得到线性pbi121载体；步骤12：目的基因片段和线性pbi121载体进行重组，得到wrky71-pbi121质粒；步骤13：将wrky71-pbi121质粒转化eha105农杆菌感受态细胞；步骤14：含有wrky71-pbi121质粒的eha105农杆菌侵染番茄子叶并获得转基因阳性苗slwrky71-oe。
3.根据权利要求2所述的抑制番茄果实成熟的调控方法，其特征在于：步骤2中，所述酶切连接反应液为：1μl的10
×
cutsmart buffer，20ng的pylgrna-atu#质粒，0.5μl的接头引物混合物，0.4 μl的bsai，0.1 μl的t4 dna ligase，0.4 μl的t4 dna ligase buffer，ddh2o补足至10 μl；pcr扩增参数为：37℃，5 min；20℃，5 min；5个循环。4.根据权利要求2所述的抑制番茄果实成熟的调控方法，其特征在于：步骤3包括2个pcr扩增反应，第一个第一轮pcr扩增为50 μl反应体系：1 μl的边切边连产物，4 μl的引物对u-f/rn，1μl的dntps，1 μl的super-fidelity dna polymerase，10 μl的5
×
super-fidelity dna polymerase buffer，33μl的ddh2o；pcr条件：95℃，1 min；95℃，10s；60℃，15s；72℃，15s；25个循环；72℃，10 min；4℃，∞；第二个第一轮pcr扩增为50μl反应体系：1 μl的边切边连产物，4 μl的引物对fn/grna-r，1μl的dntps，1 μl的super-fidelity dna polymerase，10μl的5
×
super-fidelity dna polymerase buffer，33μl的ddh2o；pcr条件：95℃，1 min；95℃，10s；60℃，15s；72℃，15s；25个循环；72℃，10 min；4℃，∞；u-f：5
’‑
ctccgttttacctgtggaatcg-3’；grna-r：5
’‑
cggaggaaaattccatccac-3’；rn代表第一轮反向引物-r1和第二轮反向引物-r2；fn代表第一轮正向引物-f1和第二轮正向引物-f2。5.根据权利要求2所述的抑制番茄果实成熟的调控方法，其特征在于：预先将位置特异引物对混合成10
×
工作液，每种1.5 μm：pt1=1.5 μlb1’+1.5 μlb2+7 μlddh2o，pt2l=1.5 μlb2’+1.5 μlbl+7 μlddh2o；靶点一反应体系为：一轮pcr扩增的2个靶点一pcr反应产物各1 μl，3 μl引物组合工作液pt1，0.6 μl的dntps，0.6 μl的super-fidelity dna polymerase，6μl的5
×
super-fidelity dna polymerase buffer，17.8 μl的ddh2o；靶点二反应体系为：一轮pcr扩增的2个靶点二pcr反应产物各1 μl，3 μl引物组合工作液pt2l，0.6 μl的dntps，0.6 μl的super-fidelity dna polymerase，6 μl的5
×
super-fidelity dna polymerase buffer，17.8 μl的ddh2o混匀后置于pcr仪中；pcr反应条件为：95℃，1min；95℃，10s，60℃， 15s，72℃，15 s，18个循环；72℃，10min；4℃，∞；b1’：5
’‑
ttcagaggtctctctcgactagtggaatcggcagcaaagg-3’；b2：agcgtgggtctcgtcagggtccatccactccaagctc；b2’：ttcagaggtctctctgacactggaatcggcagcaaagg；bl：agcgtgggtctcgaccgacgcgtccatccactccaagctc。6.根据权利要求2所述的抑制番茄果实成熟的调控方法，其特征在于：步骤6中，取二轮纯化产物20-70 ng，加入80-100ng未切割的pylcrispr/cas9-dn质粒，10
×
cutsmart buffer 1.5μl，bsai内切酶0.5 μl，用ddh2o补足体积至15 μl；混匀后置于pcr仪中37℃反应10 min进行pylcrispr/cas9-dn质粒酶切；向酶切后的反应体系中补加0.4 μl 10
×
t4dna ligase buffer和0.1 μl t4 dna ligase；再次混匀后置于pcr仪中，反应条件为37℃ 2 min，10℃ 3 min，20℃ 5 min，13个循环；37℃ 2 min；4℃ ∞。7.根据权利要求2所述的抑制番茄果实成熟的调控方法，其特征在于：步骤7中，取步骤7得到的1 μl连接产物加入到100
µ
l大肠杆菌dh5α感受态细胞中，冰上静置30 min，42℃热
激45 s，冰浴2-3 min；在离心管中加入700
ꢀµ
l的lb液体培养基，置于37℃，200 rpm摇床中振荡培养60 min；培养得到的菌液5000 rpm离心2 min，弃上清600
ꢀµ
l，吸取剩余菌液均匀涂布于含有卡那霉素的lb固体培养基(每100 ml lb固体培养基加500ul 10 mg/ml卡那霉素)上，37℃倒置培养16 h；挑取单克隆菌落，于10
ꢀµ
l无菌水中吹吸混匀，取2
ꢀµ
l菌液进行菌落鉴定，菌落pcr体系为25 μl：2 μl菌液、10 μm双元载体上的引物对sp-dl/sp-r各1μl、2
×
rapid taq master mix 12.5μl、ddh2o 8.5 μl，混匀后置于pcr仪中；pcr条件为：预变性95℃ 3min；变性95℃ 15s，退火55℃ 1min，延伸72℃ 45 s，32个循环；彻底延伸72℃ 5min；4℃ ∞；待反应结束后，在琼脂糖凝胶上检测pcr产物条带大小是否符合理论值，将条带大小正确的剩余菌液转移至4 ml含有卡那霉素的lb液体培养基中，37℃/200 rpm摇床中振荡培养16 h，质粒小提试剂盒提取质粒并跑琼脂糖凝胶验证质粒提取是否成功，将提取出的质粒送往生工公司进一步测序鉴定。8.根据权利要求2所述的抑制番茄果实成熟的调控方法，其特征在于：步骤8中，取100 μl农杆菌感受态细胞eha105，在冰浴中使其融化，加入1μl测序正确的cas9质粒，用手轻轻拨打离心管底部，混匀，依次在冰上静置5 min、液氮5 min、37℃水浴5 min、冰浴5 min；加入700 μl无抗生素的lb液体培养基，于28℃振荡培养2-3 h；6000 rpm 离心1 min收菌，留取100 μl左右上清，吹打混匀重悬菌体，涂布于lb-kana/rif固体培养基上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天。9.根据权利要求2所述的抑制番茄果实成熟的调控方法，其特征在于：步骤9中，挑取步骤9中构建好的cas9载体的农杆菌单菌落于3 ml含kana和rif的lb液体培养基中，200 rpm，28℃培养12-16 h后取300
ꢀµ
l于20 ml含kana和rif的lb液体培养基中，200 rpm，28℃震荡培养6-7 h，用分光光度计检测菌液od
600
至0.5-0.6；5000 rpm室温离心10 min收集菌体，菌体用无菌水稀释至od
600
=0.1-0.2，现配现用；将番茄子叶和茎段黑暗预培养2 d后浸泡于稀释好的农杆菌侵染液中，震荡，侵染5 min后倒掉侵染液，用枪头吸掉多余侵染液，将子叶和茎段再经过含不同植物激素的培养基上分别发芽、芽伸长、生根的过程，将生根的外植体转移至营养土中进行后续测序鉴定，进而得到转化的番茄植株；随后通过设计靶点上下游引物，提取转基因番茄植株dna，进行pcr扩增，并进行测序鉴定，分析slcas基因是否发生编辑。10.根据权利要求2所述的抑制番茄果实成熟的调控方法，其特征在于：步骤10中，pcr扩增体系为50 μl：番茄cdna 2μl、上游引物-f和下游引物-r各2μl、5
×
高保真dna聚合酶缓冲液10μl、高保真dna聚合酶1μl、脱氧核糖核苷三磷酸dntp混合物1μl、双蒸水补至50 μl。11.根据权利要求2所述的抑制番茄果实成熟的调控方法，其特征在于：步骤10中，一轮pcr总反应体系为50μl，其中含有4μl 模板（为番茄提取rna后反转录得到的cdna），1μl正向引物f1，1μl反向引物r1，4μl dntp，5μl pcrsit，1μl pfu酶，10μl 5
×
pfu buffer，24μl 无菌ddh2o；二轮pcr与一轮pcr体系相同，只是用一轮pcr产物作为模版，将引物对换成f2与r2；pcr扩增参数为：95℃预变性 5min，95℃变性 20s，55℃退火 20s，72℃ 延伸1min25s，38个循环,72℃延伸5min,4℃保存；
二轮产物使用普通dna纯化试剂盒进行纯化回收。12.根据权利要求2所述的抑制番茄果实成熟的调控方法，其特征在于：步骤11中，酶切总体系为50μl，其中含有20μl pbi121载体质粒/二轮纯化产物，2μl xhoi，2μl bamhi，5μl cut smart buffer，21μl无菌ddh2o；pbi121载体37℃酶切4h，纯化产物37℃酶切过夜；使用dna胶回收试剂盒将得到的酶切产物分别进行切胶纯化。13.根据权利要求2所述的抑制番茄果实成熟的调控方法，其特征在于：步骤12中，目的基因片段和线性pbi121载体用一步克隆试剂盒clonexpress
ⅱꢀ
one step cloning kit进行重组，重组条件为：37℃连接30 min，结束后置于冰上保存；取步骤1得到的pcr扩增产物加入到100
µ
l大肠杆菌dh5α感受态细胞中，冰上静置30 min，42℃热激45s，冰浴2-3 min；在离心管中加入700
µ
l的lb液体培养基，置于37℃，150 rpm摇床中振荡培养45 min；培养得到的菌液4000rpm离心2min，弃上清200
µ
l，吸取剩余菌液均匀涂布于含有卡那霉素的固体培养基(每100 ml固体lb加 500 ul 10 mg/ml 卡那霉素)上，37℃倒置培养16h；挑取单克隆菌落，于10
µ
l无菌水中吹吸混匀，取2
µ
l菌液进行菌落鉴定；挑取6个阳性克隆测序。14.根据权利要求2所述的抑制番茄果实成熟的调控方法，其特征在于：步骤13中，进行菌落鉴定时，菌落pcr体系为25
µ
l：2
µ
l菌液、1
µ
l正向引物f2、1
µ
l反向引物r2、12.5
µ
l的2
×
taq聚合酶混合体系、8.5
µ
l双蒸水，冰上混匀；pcr参数为：95℃预变性3min；95℃变性15s；55℃退火15s，72℃延伸2min15s，35个循环；72℃延伸5min；4℃保存，待反应结束后，产物经琼脂糖凝胶电泳，检测条带大小是否符合结果，将条带位置正确的单克隆扩大培养，即在菌液中加入lb液体培养基5 ml，并加入25
µ
l 的浓度为10mg/ml卡那霉素后混匀，37℃，200 rpm摇床中振荡培养12-16h，然后提取菌液中的质粒，并将提取的质粒于-20℃保存；在pbi121载体上wrky71基因片段的两端设计引物进行测序。15.根据权利要求2所述的抑制番茄果实成熟的调控方法，其特征在于：步骤13中， 将容纳有冰水混合状态的eha105农杆菌感受态细胞的试管插入冰中，然后加入1μl的wrky71-pbi121质粒，拨打管底混匀，依次于冰上静置5分钟、液氮5分钟、37℃水浴5分钟、冰浴5分钟；然后接种于700ml液体lb培养基，置于37℃，150rpm摇床中振荡培养2-3h；5000rpm离心1min，留取100ul左右上清轻轻吹打重悬菌液涂布于含卡那霉素和利福平的lb平板（每100 ml固体lb加500ul 10 mg/ml 卡那霉素和500ul 10 mg/ml 利福平上，倒置放于28度培养箱培养2~3天；有菌落长出后，用枪头随机挑取若干单克隆菌落，溶于10μl的无菌水中制成菌液，取2
µ
l菌液进行菌落鉴定；向条带位置鉴定正确的菌液中加5ml的lb液体培养基、10
µ
l的浓度为10mg/ml利福平，25μl的浓度为10的mg/ml卡那霉素，置于37℃摇床，200 rpm振荡培养过夜，得到含有wrky71-pbi121质粒的eha105农杆菌。16.根据权利要求2所述的抑制番茄果实成熟的调控方法，其特征在于：步骤14中，将番茄种子用次氯酸钠和酒精清洗消毒以后，播种在生根培养基t0上，暗培养5-7天等待发芽后拿到光照下培养；待芽长成两片子叶时即可准备剪叶子，将番茄子叶剪成小正方形，一片子叶可剪成两半，以及茎剪成小段，将叶和茎摆在预培养基t1上；
将预培养2 d后的外植体浸泡于含有wrky71-pbi121质粒的eha105农杆菌侵染液中，震荡，侵染5min后倒掉侵染液，用枪头吸掉多余侵染液，将外植体重新放回预培养基t1上，暗培养2天后，转至芽诱导培养基t
21
上，使用卡那霉素进行筛选，背面朝下，25℃，16h光照培养7 d后，转入新的芽诱导培养基t
21
上继代培养；此后每隔2周更换新的芽诱导培养基t
21
继代培养，待外植体发芽2-3cm时，转入芽伸长培养基t
22
中，培养3-4周，每两周更换新的芽伸长培养基t
22
，当芽伸长至4-5cm时，剪去根部的愈伤组织，转入生根培养基t3中，培养3-4周，得到生根的小苗；将生根的小苗转入土盆内，使幼苗生长3-7 d，结束后，将番茄小苗转移至土培室内，16 h光照正常生长，得到转基因阳性苗。17.根据权利要求2所述的抑制番茄果实成熟的调控方法，其特征在于：步骤14中，侵染液的配置：挑取含有wrky71-pbi121质粒的eha105农杆菌单菌落于3ml的lb液体培养基中（含15ul 10mg/ml的卡那霉素和15ul10mg/ml的利福平），200rpm，28℃过夜；次日取300
µ
l的菌液于20mllb液体培养基中（含100ul10mg/ml的卡那霉素和100ul10mg/ml的利福平），200 rpm，28℃震荡培养6-7 h；用分光光度计检测od
600
至0.5-0.6；5000 rpm室温离心10 min收集菌体，菌体用无菌水稀释至od
600
=0.1-0.2，即得含有wrky71-pbi121质粒的eha105农杆菌侵染液。
技术总结
一种抑制番茄果实成熟的基因SlWRKY71及其调控方法，所述基因的核苷酸序列如Seq No.1所示。本发明通过从番茄中得到SlWRKY71基因完整的编码序列，设计靶点，将靶点连接到载体CRIPSR-Cas9上，利用农杆菌侵染法转化植物，获得基因编辑植株，对基因编辑植株进行了分析。对基因编辑植株进行了分析。对基因编辑植株进行了分析。
技术研发人员：姚改芳 张华 孙忱 胡康棣 孙红叶 苟沙沙 安欣
受保护的技术使用者：合肥工业大学
技术研发日：2022.09.19
技术公布日：2022/12/12