一种用于防治水稻抗性鳞翅目害虫的融合蛋白及应用

(一)本发明涉及一种防治水稻害虫以及抗性害虫的方法，特别涉及一种防治水稻鳞翅目害虫以及抗性鳞翅目害虫的融合蛋白及其应用。

背景技术：

0、(二)背景技术

1、害虫给全球农业生产带来每年数十亿美元的损失。害虫的防治目前主要依靠使用化学农药和推广转基因作物。化学农药的残留会对人体健康和环境带来不良影响。利 用生物技术方法培育含有抗虫基因的转基因抗虫农作物，可以大幅度降低化学杀虫剂 的使用，有效保护农作物免受害虫为害。杀虫蛋白质有多种，目前使用最多的是来自 苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringiensis,bt)的杀虫晶体蛋白，如cry1a、cry1f等； 以及bt营养期杀虫蛋白，如vip3等(estruch,warren et al.1996,adang,crickmore et al. 2014)。bt杀虫蛋白质在转基因植物上的应用已经超过二十年，2018年全球抗虫转基 因作物的应用面积超过7000万公顷(isaaa 2019)。

2、杀虫晶体蛋白是发现最早、使用最广泛的bt杀虫蛋白质。目前商业化应用的抗 虫转基因水稻中使用较多的杀虫晶体蛋白是cry1ab，cry1fa和cry2ab等，这些杀 虫蛋白质对部分鳞翅目昆虫如水稻螟、棉铃虫、小菜蛾、二化螟、三化螟、大螟、稻 纵卷叶螟等具有较高的杀虫活性。其中，转cry1ab基因玉米、转cry1ac基因棉花已 经被广泛应用。

3、长期大量地使用单一的杀虫蛋白，可以导致害虫对bt杀虫蛋白质抗性的产生和发展(carriere,crickmore et al.2015)。自2005年全球发现第一例bt抗性害虫以来， 全球抗性害虫发生量逐年升高，并呈现快速增长的趋势(tabashnik and carrière 2017)。在实验室(人工气候环境中)和田间(自然环境中)都已经筛选或发现了抗bt蛋白 的鳞翅目害虫。截至2019年，全球已报道44例抗性害虫实例，分为三种类型：一是 实际监测到靶标昆虫对bt作物不再敏感的抗性害虫实例，其数量由2006年的4例 上升到2019年的19例；二是检测到昆虫的某些基因位点发生了进化，但未发现其对 bt作物敏感性的降低，这样的案例数为19个；另外6例为抗性害虫早期预警。田间 检测到部分鳞翅目害虫已经产生了抗性，如bagla等报道了中国新疆、印度等地种植 的表达cry1ac蛋白的转基因棉花上发现了抗性棉铃虫和抗性棉红铃虫(bagla 2010)；monnerat等报道了巴西种植的表达cry1fa蛋白的转基因玉米产品上发现了抗性草地 贪夜蛾(monnerat,martins et al.2015)。随着应用率的提高和应用时间的增长，鳞翅目 害虫对现有的bt杀虫晶体蛋白和营养期杀虫蛋白发展出抗性的实例将会越来越多。 除了挖掘新的抗虫基因资源之外，现有的抗性害虫管理方法主要有“高剂量/庇护所” 策略和“基因堆叠”策略。“高剂量/庇护所”策略在农业生产中推行较为简便，因此 被广泛应用于转基因作物的种植中；“基因堆叠”则是将两种不同杀虫机理的杀虫蛋 白在同一个转化体中同时表达，从而达到叠加杀虫的效果。这两种策略的侧重点有所 不同，在实际应用中往往共同使用，以便更好地实现抗性昆虫管理。

4、目前应用最广泛、对鳞翅目昆虫杀虫效果最好的bt杀虫蛋白有两类，分别是杀 虫晶体蛋白(crys)和营养期杀虫蛋白(vips)。cry蛋白对鳞翅目螟蛾科害虫(如 玉米螟、二化螟等)的杀虫活性很高，但是对夜蛾科害虫(如草地贪夜蛾、甜菜夜蛾) 的杀虫活性很低；vip蛋白中有杀虫活性的大部分是vip3a蛋白，其中大部分vip3a 蛋白对螟蛾科害虫没有杀虫活性，而对夜蛾科害虫活性很高，例如先正达公司在美国、 巴西广泛推广的转化体mir162即为表达vip3aa20蛋白的转基因玉米。由于cry蛋 白与vip3蛋白对害虫的杀虫机理完全不同，即便对同种害虫，它们在昆虫中肠上的 结合受体和作用机理也完全不同，因此开发对螟蛾科害虫具有杀虫活性的vip3蛋白 能够更好地实现水稻鳞翅目害虫的治理和抗性管理。

5、申请人前期研发了对鳞翅目害虫具有高杀虫活性的vip3a蛋白。在中国专利cn112390893和cn113793639中，已经详细描述了vip3af等多种杀虫蛋白对抗性草 地贪夜蛾、抗性玉米螟的杀虫活性。全球商业化的bt转基因水稻仅有三例：gm shanyou 63、huahui-1/tt51-1、tarom molaii+cry1ab(isaaa)。该三例转基因水稻 均表达cry蛋白，长期的单一使用导致水稻害虫对其产生抗性。本技术针对水稻害虫， 尤其是对cry蛋白不敏感的抗性二化螟等重要螟蛾科水稻害虫进行了详细的生物活性 测定，筛选出cry1ab与vip3af/vip3ag的融合蛋白对二化螟、稻纵卷叶螟、大螟以 及抗性害虫的杀虫活性，发现了融合杀虫蛋白对水稻害虫具有协同作用的杀虫效果， 具有较高的应用价值和广泛的应用前景。

技术实现思路

0、(三)
技术实现要素：

1、本发明目的是提供一种用于防治水稻抗性鳞翅目害虫的融合蛋白以及在防治水稻害虫中的应用。本发明采用融合cry蛋白和vip蛋白的策略，达到防治水稻害虫尤 其是对cry蛋白不敏感的抗性二化螟等重要螟蛾科水稻害虫的目的，同时延缓害虫对bt蛋白抗性的发生。

2、为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

3、本发明提供了一种用于防治水稻抗性鳞翅目害虫的融合蛋白，所述融合蛋白由bt杀虫晶体蛋白与bt营养期杀虫蛋白通过融合连接构成；所述融合蛋白的n端为 bt杀虫晶体蛋白具有杀虫活性的部分多肽，c端为bt营养期杀虫蛋白；所述bt杀 虫晶体蛋白为bt杀虫晶体蛋白cry1ab，氨基酸序列为seq id no:1所示；所述bt 营养期杀虫蛋白为bt营养期杀虫蛋白vip3af或bt营养期杀虫蛋白vip3ag，氨基 酸序列分别为：seq id no:2、seq idno:3所示。

4、优选的，所述融合蛋白由bt杀虫晶体蛋白cry1ab与bt营养期杀虫蛋白vip3af 通过融合连接构成，氨基酸序列为seq id no:4，编码基因cry1ab-vip3af的核苷酸序 列为seq id no:9；或者所述融合蛋白质cry1ab-vip3ag由bt杀虫晶体蛋白cry1ab 与bt营养期杀虫蛋白vip3ag通过融合连接构成，氨基酸序列为seq id no:5，编 码基因cry1ab-vip3ag的核苷酸序列为seq id no:10。

5、本发明还提供一种所述融合蛋白的编码基因。

6、本发明还提供一种含所述融合蛋白的编码基因的重组dna载体、工程菌、基因 表达盒，所述基因表达盒包含所述融合蛋白的核苷酸序列；所述重组dna载体包含 所述基因表达盒。

7、进一步，所述基因表达盒中包括至少一个与所述目的基因可操作连接的驱动其表达的调控序列，比如启动子、终止子。通常能够控制目的基因在植物中表达的启动子 与编码融合蛋白的核苷酸序列5’端进行功能性连接。这些启动子包括camv的35s 启动子(kay,chan et al.1987)、水稻ubiquitin-1启动子(christensen,sharrock et al. 1992)、拟南芥uniqitin启动子(norris,meyer et al.1993)等。终止子与抗虫融合蛋白质 编码框的3’端连接。常用的终止子包括camv的35s终止子(franck,guilley et al. 1980)、农杆菌的nos终止子(bevan,barnes et al.1983)等。

8、本发明还提供了一种所述融合蛋白在防治水稻抗性鳞翅目害虫中的应用，所述应用的方法为：将含所述融合蛋白编码基因的水稻与靶标害虫接触，达到防治靶标害虫 的目的。所述靶标害虫包括鳞翅目害虫或抗性鳞翅目害虫，所述鳞翅目害虫包括二化 螟、大螟、稻纵卷叶螟，所述抗性鳞翅目害虫包括对cry毒素不敏感的抗性二化螟、 抗性大螟、抗性稻纵卷叶螟。

9、本发明还提供一种用于管理水稻抗性鳞翅目害虫的植物细胞，所述的植物细胞为含所述融合蛋白编码基因的水稻细胞。

10、本发明含所述融合蛋白编码基因的水稻细胞是将包含所述融合蛋白的编码基因表达盒或重组dna载体的农杆菌转化载体通过成熟的转化方法导入到水稻细胞(hiei,komari et al.1997)中。水稻的转化方法在技术上已经成熟，本专业的一般技术人员就 可以实现这个技术目的。

11、与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：(1)本发明提供的表达杀虫融合蛋白水稻与现有杀虫蛋白水稻相比，对水稻鳞翅目害虫的杀虫活性更高，不仅能有效 防治二化螟、大螟、稻纵卷叶螟，对cry毒素不敏感的抗性二化螟、抗性大螟、抗性 稻纵卷叶螟同样具有高效的活性。(2)融合蛋白中杀虫蛋白质cry和vip3在植物中 实现了同时等量表达，有利于抗虫蛋白发挥生物活性，不仅有效减缓自然界中害虫抗 性发生的风险并且高效防治抗性鳞翅目害虫。

12、(四)具体实施方式

13、下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

14、本发明以下实施例中所使用的分子生物学和生物化学方法均为已知的技术。在ausubel编写的john wiley and sons公司出版的current protocols in molecularbiology， 和j.sambrook等编写的cold spring harbor laboratory press(2001)出版的molecular cloning:a laboratory manual,3rd ed.等文献均有详细的说明。

15、实施例1、抗虫融合基因的载体构建、重组蛋白质的制备

16、本发明涉及的编码基因均由上海生工公司进行人工合成，其中，抗虫融合蛋白质cry1ab-vip3af由bt杀虫晶体蛋白cry1ab与bt营养期杀虫蛋白vip3af通过融合 连接构成，氨基酸序列为seq id no:4，编码基因cry1ab-vip3af的核苷酸序列为seq id no:9。抗虫融合蛋白质cry1ab-vip3ag由bt杀虫晶体蛋白cry1ab与bt营养 期杀虫蛋白vip3ag通过融合连接构成，氨基酸序列为seq id no:5，编码基因 cry1ab-vip3ag的核苷酸序列为seq idno:10。bt杀虫晶体蛋白cry1ab氨基酸序列 为seq id no:1，编码基因cry1ab的核苷酸序列为seq id no:6；bt营养期杀虫蛋 白vip3af氨基酸序列为seq id no:2，编码基因vip3af的核苷酸序列为seq id no:7； bt营养期杀虫蛋白vip3ag氨基酸序列为seq id no:3，编码基因vip3ag的核苷酸 序列为seq id no:8。

17、seq id no:4

18、mdnnpninecipynclsnpevevlggerietgytpidislsltqfllsefvpgagfvlglvdiiwgifgpsqwdaflv qieqlinqrieefarnqaisrleglsnlyqiyaesfreweadptnpalreemriqfndmnsalttaiplfavqnyq vpllsvyvqaanlhlsvlrdvsvfgqrwgfdaatinsryndltrlignytdhavrwyntglervwgpdsrdw irynqfrreltltvldivslfpnydsrtypirtvsqltreiytnpvlenfdgsfrgsaqgiegsirsphlmdilnsiti ytdahrgeyywsghqimaspvgfsgpeftfplygtmgnaapqqrivaqlgqgvyrtlsstlyrrpfniginnqq lsvldgtefaygtssnlpsavyrksgtvdsldeippqnnnvpprqgfshrlshvsmfrsgfsnssvsiirapmfswi hrsaefnniipssqitqipltkstnlgsgtsvvkgpgftggdilrrtspgqistlrvnitaplsqryrvriryasttnl qfhtsidgrpinqgnfsatmssgsnlqsgsfrtvgfttpfnfsngssvftlsahvfnsgnevyidriefvpaevtfe aeydleraqkavnelftssnqiglktdvtdyhidqvrgpggkgmnknntklstralpsfidyfngiygfatgikd imnmifktdtggnltldeilknqqllneisgkldgvngslndliaqgnlntelskeilkianeqnqvlndvnnkl daintmlhiylpkitsmlsdvmkqnyalslqieylskqlqeisdkldiinvnvlinstlteitpayqrikyvnekfe eltfatettlkvkkdsspadildelteltelaksvtkndvdgfefylntfhdvmvgnnlfgrsalktaseliake nvktsgsevgnvynflivltalqakafltlttcrkllgladidytsimnehlnkekeefrvnilptlsntfsnpny akvkgsdedakmiveakpghalvgfemsndsitvlkvyeaklkqnyqvdkdslseviygdtdklfcpdqseqi yytnnivfpneyvitkidftkkmktlryevtanfydsstgeidlnkkkvesseaeyrtlsanddgvymplgvise tfltpingfglqadensrlitltcksylrelllatdlsnketklivppsgfisnivengsieednlepwkannknay vdhtggvngtkalyvhkdggfsqfigdklkpkteyviqytvkgkpsihlkdentgyihyedtnnnlkdyqtitk rfttgtdlkgvylilksqngdeawgdkftileikpaedllspelinpnswittpgasisgnklfinlgtngtfrqsls lnsystysisftasgpfnvtvrnsrevlfersnlmsstshisgtfktesnntglyvelsrrsgggghisfenvsik。

19、seq id no:5

20、mdnnpninecipynclsnpevevlggerietgytpidislsltqfllsefvpgagfvlglvdiiwgifgpsqwdaflv qieqlinqrieefarnqaisrleglsnlyqiyaesfreweadptnpalreemriqfndmnsalttaiplfavqnyq vpllsvyvqaanlhlsvlrdvsvfgqrwgfdaatinsryndltrlignytdhavrwyntglervwgpdsrdw irynqfrreltltvldivslfpnydsrtypirtvsqltreiytnpvlenfdgsfrgsaqgiegsirsphlmdilnsiti ytdahrgeyywsghqimaspvgfsgpeftfplygtmgnaapqqrivaqlgqgvyrtlsstlyrrpfniginnqq lsvldgtefaygtssnlpsavyrksgtvdsldeippqnnnvpprqgfshrlshvsmfrsgfsnssvsiirapmfswi hrsaefnniipssqitqipltkstnlgsgtsvvkgpgftggdilrrtspgqistlrvnitaplsqryrvriryasttnl qfhtsidgrpinqgnfsatmssgsnlqsgsfrtvgfttpfnfsngssvftlsahvfnsgnevyidriefvpaevtfe aeydleraqkavnelftssnqiglktdvtdyhidqvrgpggkgmnmnntklnaralpsfidyfngiygfatgik dimnmifktdtggnltldeilknqqllneisgkldgvngslndliaqgnlntelskeilkianeqnqvlndvnnk lnaintmlhiylpkitsmlndvmkqnyalslqieylskqlqeisdkldvinvnvlinstlteitpayqrmkyvnek fedltfatettlkvkknsspadildelteltelaksvtkndvdgfefylntfhdvmvgnnlfgrsalktaselia kenvktsgsevgnvynflivltalqakafltlttcrkllgladidytfimnehldkekeefrvnilptlsntfsnp nyakakgsnedakiiveakpgyalvgfemsndsitvlkayqaklkqdyqvdkdslseivygdmdkllcpdqse qiyytnniafpneyvitkitftkkmnslryeatanfydsstgdidlnktkvesseaeystlsastdgvymplgiise tfltpingfgivvdensklvnltcksylrevllatdlsnketklivppigfisnivengnlegenlepwkannkna yvdhtggvngtkalyvhkdgefsqfigdklkskteyviqyivkgkasillkdekngdciyedtnngledfqtitk sfitgtdssgvhlifnsqngdeafgenftiseirlsedllspelinsdawvgsqgtwisgnsltinsnvngtfrqnls lesystysmnfnvngfakvtvrnsrevlfeknypqlspkdisekfttaanntglyvelsrftsggainfrnfsik。

21、利用大肠杆菌(escherichia coli)pet表达系统进行重组蛋白质的表达和制备，即 将目的基因导入合适的表达载体中，再将表达载体转入合适的表达菌株，在一定条件下诱导目的基因的表达，制备重组蛋白质。

22、抗虫融合蛋白cry1ab-vip3af的制备过程如下：将融合基因cry1ab-vip3af克隆到表达载体pet32a(novagen，69015-3，美国)的bamhi和saci这二个限制性内切酶 酶切位点之间，获得重组质粒pet32a-cry1ab-vip3af；重组质粒通过热击转化法导入 大肠杆菌bl21(de3)细胞系，在含50mg/l卡那霉素的lb固体培养基上37℃过夜培 养，筛选得到单克隆阳性菌落；单个菌落接种至含50mg/l氨苄青霉素的lb液体培 养基，37℃过夜培养后，取0.2ml菌液继代接种至装有200毫升含50mg/l氨苄青霉 素的lb液体培养液的锥形瓶中，37℃振荡培养至od600＝0.6，然后加入iptg(isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside)至终浓度为0.5mm，并继续在同样的条件下振荡培养4小 时，诱导重组蛋白质的表达；表达完成后，将细菌培养液5000g离心15分钟，弃掉 上清培养液，收集细胞沉淀，并以50毫升20mm磷酸缓冲液(pbs，ph＝7.4)重悬 细胞；随后将重悬液置于冰水中充分冷却后，用超声波破碎仪粉碎细胞(探头直径 10mm，以650w、20khz碎15min)，离心，上清和沉淀分别经聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)鉴定后，将含有正确目的条带的蛋白质样品储存于-80℃冰箱中备用， 获得抗虫融合蛋白cry1ab-vip3af悬浮液，即为重组蛋白质悬浮液。所述lb液体培 养基组成为：蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、氯化钠10g/l，溶剂为双蒸水，120℃ 高温高压灭菌15分钟；lb固体培养基是在lb液体培养基中再加入15g/l琼脂，高 温高压灭菌后倒置于已灭菌的培养皿中冷却即可。

23、以上为融合蛋白质cry1ab-vip3af的制备方法。以相同的实验方法，可以获得抗虫融合蛋白质cry1ab-vip3ag、杀虫蛋白质cry1ab、vip3af和vip3ag。同时，本实 施例还制备了cry1ab-vip3aa20融合蛋白作为后续实施例的对照，氨基酸序列为seq id no:11，编码基因cry1ab-vip3aa20的核苷酸序列为seq id no:12。

24、实施例2、重组蛋白质对水稻鳞翅目昆虫的生物活性测定

25、实验对象：选取二化螟、大螟、稻纵卷叶螟、以及对cry1ab毒素不敏感的抗性 二化螟、抗性大螟、抗性稻纵卷叶螟作为被试昆虫。抗性二化螟、抗性大螟、抗性稻 纵卷叶螟采自海南三亚试验基地，通过人工饲养筛选获得，具体方法参考文献资料 (kain,wendy c.,et al."inheritance of resistance to bacillus thuringiensis cry1ac toxin in agreenhouse-derived strain of cabbage looper(lepidoptera:noctuidae)."journalof economic entomology 97.6(2004):2073-2078.；huang,fangneng,et al."baselinesusceptibility and changes in susceptibility to bacillus thuringiensissubsp.kurstaki under selection pressure in european corn borer(lepidoptera:pyralidae)."journal of economic entomology 90.5(1997):1137-1143.)提供的方法进行筛选。抗性二化螟、抗性大螟、 抗性稻纵卷叶螟对bt杀虫晶体蛋白(cry1ab)不敏感，普通二化螟、大螟、稻纵卷 叶螟对bt杀虫晶体蛋白质敏感。

26、实验组：实施例1方法制备的重组蛋白质进行生物活性的预实验(分别设置 1ng/cm2、10ng/cm2、100ng/cm2、1000ng/cm2四组浓度)；根据预实验结果，设置8 组浓度梯度(浓度范围如下表1所示，以pbs溶液稀释)，测定其对昆虫具有50％ 致死率的浓度区间。每组浓度测试虫数为100头。

27、表1对二化螟生物活性测定的重组蛋白浓度梯度表(ng/cm2)

28、

29、

30、表2对大螟生物活性测定的重组蛋白浓度梯度表(ng/cm2)

31、 重组蛋白质 浓度1 浓度2 浓度3 浓度4 浓度5 浓度6 浓度7 浓度8 cry1ab 25 50 100 150 200 300 400 500 vip3af 10 25 50 75 100 125 150 200 vip3ag 10 25 50 75 100 125 150 200 cry1ab-vip3af 10 20 30 40 50 60 75 100 cry1ab-vip3ag 10 20 30 40 50 60 75 100 cry1ab-vip3aa20 25 50 100 150 200 300 400 500 

32、表3对稻纵卷叶螟生物活性测定的重组蛋白浓度梯度表(ng/cm2)

33、 重组蛋白质 浓度1 浓度2 浓度3 浓度4 浓度5 浓度6 浓度7 浓度8 cry1ab 25 50 100 150 200 300 400 500 vip3af 10 25 50 75 100 125 150 200 vip3ag 10 25 50 75 100 125 150 200 cry1ab-vip3af 10 20 30 40 50 60 75 100 cry1ab-vip3ag 10 20 30 40 50 60 75 100 cry1ab-vip3aa20 25 50 100 150 200 300 400 500 

34、表4对抗性二化螟生物活性测定的重组蛋白浓度梯度表(ng/cm2)

35、 重组蛋白质 浓度1 浓度2 浓度3 浓度4 浓度5 浓度6 浓度7 浓度8 cry1ab 25 50 100 150 200 300 400 500 vip3af 10 25 50 75 100 125 150 200 vip3ag 10 25 50 75 100 125 150 200 cry1ab-vip3af 10 20 30 40 50 60 75 100 cry1ab-vip3ag 10 20 30 40 50 60 75 100 cry1ab-vip3aa20 50 100 200 300 400 600 800 1000 

36、表5对抗性大螟生物活性测定的重组蛋白浓度梯度表(ng/cm2)

37、 重组蛋白质 浓度1 浓度2 浓度3 浓度4 浓度5 浓度6 浓度7 浓度8 cry1ab 25 50 100 150 200 300 400 500 vip3af 10 25 50 75 100 125 150 200 vip3ag 10 25 50 75 100 125 150 200 cry1ab-vip3af 10 20 30 40 50 60 75 100 cry1ab-vip3ag 10 20 30 40 50 60 75 100 cry1ab-vip3aa20 50 100 200 300 400 600 800 1000 

38、表6对抗性稻纵卷叶螟生物活性测定的重组蛋白浓度梯度表(ng/cm2)

39、 重组蛋白质 浓度1 浓度2 浓度3 浓度4 浓度5 浓度6 浓度7 浓度8 cry1ab 25 50 100 150 200 300 400 500 vip3af 10 25 50 75 100 125 150 200 vip3ag 10 25 50 75 100 125 150 200 cry1ab-vip3af 10 20 30 40 50 60 75 100 cry1ab-vip3ag 10 20 30 40 50 60 75 100 cry1ab-vip3aa20 50 100 200 300 400 600 800 1000 

40、阴性对照组：阴性对照的准备方法与实施例1相同，唯一的区别是大肠杆菌表达菌株中转入的质粒为不含任何插入dna序列的pet32a空载体。

41、测定方法：以表面平铺法测定重组蛋白质对昆虫的致死中浓度lc50。

42、昆虫人工饲料煮熟后平铺到24孔培养板(每孔直径为1.5cm)中，等待饲料凝固。每块24孔板中随机设置20个孔为实验组，4个为阴性对照组。实验组每孔的饲料表 面铺上重组蛋白200微升，阴性对照组每孔的饲料表面铺上阴性对照蛋白200微升， 待整块板铺完后将其放置在120rpm的摇床上晃动至液体晾干。每孔接入2头被试昆 虫，并用透气封口膜封闭，在28℃培养箱中遮光饲养7天，统计昆虫死亡率，得出对 应的致死中浓度lc50，结果如下表7所示。

43、表7重组蛋白质对两种鳞翅目害虫的致死中浓度(lc50)测定

44、

45、

46、注：a、95％ci，95％置信区间；b.n/a:not active，无生物活性。

47、从上述生物测定的结果中可以看出，与单独蛋白和融合蛋白cry1ab-vip3aa20 相比，重组的融合蛋白质cry1ab-vip3aj和cry1ab-vip3ag不仅显著提高了对二化 螟、大螟和稻纵卷叶螟的杀虫效果，同时对抗性二化螟、抗性大螟和抗性稻纵卷叶螟 有高效的生物活性。

48、实施例3、根癌农杆菌转化t-dna载体的构建

49、根癌农杆菌转化t-dna载体是基于pcambia1300(ncbi序列编号af234296)载 体而构建的。抗虫融合蛋白编码基因cry1ab-vip3af的核苷酸序列(seq id no:9，5’ 端被设计上bamhi位点，3’端被设计上saci位点，bamhi-saci酶切片段)与玉米的 pepc终止子(genebank no:x15239，5’端被设计上saci位点，3’端被设计上kpni 位点，saci-kpni片段)连接，获得包括基因和终止子的bamhi-kpni片段。抗虫融合 蛋白编码基因cry1ab-vip3ag的核苷酸序列(seq id no:10)的设计和酶切方式与上 述cry1ab-vip3af的方法一致。

50、玉米的ubiquitin-1启动子(genebank no:s94464)从玉米的基因组中通过pcr 获得，使用的引物分别是：

51、zmubi-f(5’gcgaagcttgcatgcctacagtgcagcgtgacccggtcgtgc， 添加了hindiii位点)；

52、zmubi-r(5’gtgggatcctctagagtcgacctgcagaagtaacaccaaacaa cag，添加了bamhi位点)。

53、玉米ubiquitin-1启动子经过hindiii和bamhi酶切后，与cry1da-vip3af融合基因-终止子片段(bamhi-kpni片段)连接到预先经过hindiii-kpni酶切的pcambia 1300 载体中，获得t-dna载体p1300-cry1ab-vip3af。使用相同的酶切和连接方式，获得另 一个t-dna载体p1300-cry1ab-vip3ag。显然，这里仅仅列举了一个实例。将上述玉 米泛素启动子替换为其他合适的启动子(如camv 35s启动子、拟南芥泛素启动子)， 或是将玉米pepc终止子替换为其他合适的终止子(如35s终止子、农杆菌nos终止 子)，均可以构建得到用于植物转化的t-dna载体。t-dna载体通过电击转化法转 入农杆菌lb4404菌株中，鉴定正确的阳性克隆菌，即为含有目的基因 (p1300-cry1ab-vip3af和p1300-cry1ab-vip3ag)的农杆菌，保存于-80℃冰箱。

54、实施例4、转基因水稻的获得

55、转基因水稻的获得方法是根据现有技术，采用根癌农杆菌介导法转化水稻成熟胚(hiei,komari et al.1997)。选取成熟饱满的水稻种子去壳，诱导产生愈伤组织为转化 材料。取实施例3制备的含有目的基因的农杆菌划板，挑单菌落接种。将待转化的愈 伤组织放入od＝0.7左右的农杆菌液中(含乙酰丁香酮)，让农杆菌结合到愈伤组织 表面，然后把愈伤组织转移到共培养基中，共培养2～3天。用无菌水冲洗转化后的 愈伤组织，转移到含抗生素(50ng/ml潮霉素)的筛选培养基上，筛选培养两个月(中 间继代一次)。把筛选后生长活力良好的愈伤组织转移到预分化培养基上培养20天左 右，然后将预分化好的愈伤组织转移到分化培养基，14小时光照分化发芽。2～3周 后，把抗性再生植株转移到生根培养基上壮苗生根，最后将再生植株洗去琼脂移植到 温室，即为t0代水稻转化株系，含有目的基因p1300-cry1ab-vip3af的株系记为cf， 含有目的具有p1300-cry1ab-vip3ag的株系记为cg，作为候选材料。

56、实施例5、水稻转化株系中抗虫蛋白表达量的测定

57、测定实施例4遗传转化获得的t0代水稻转化株系中抗虫蛋白的含量。取植株表 现型与非转基因无明显差异的6个株系，每个株系在v6叶期的叶片组织50mg，每个 叶片组织取3份样品作为重复；液氮研磨后加入500微升pbs缓冲液，充分混合后 12000rpm离心5min，将上清液稀释500倍后进行酶联免疫法(elisa)测定，测定 时使用试剂为envirologix公司的elisa定量试剂盒(产品编号ap-003)，参照产品 使用说明书进行操作。

58、对转化筛选获得的水稻转化株系苗测定结果如下表8所示，表达量数据为该株系三个重复的平均值。本领域研究证明融合蛋白里的两个蛋白是等量表达的(xu etal.2019)，故利用envirologix公司的elisa定量试剂盒(产品编号ap-003)测定cry1ab 的表达量，根据蛋白的分子量推测融合蛋白的表达量，最终得到的数据如下表8所示， 其中cf2、cf1、cf5和cf6表达量较高，cg2、cg3、cg5和cg6表达量较高。

59、表8水稻转化株系中抗虫蛋白表达量的测定

60、

61、注：*μg/g-fwt：微克每克新鲜组织。

62、实施例6、转基因抗虫水稻转化体的筛选

63、取实施例5测定过表达量的转基因水稻，进行水稻鳞翅目害虫及抗性害虫的室内生物活性测定，从中筛选出对水稻害虫具有高杀虫活性的转化株系。取5-6cm长的新 鲜的植物叶片组织，放置在直径7.5cm的培养皿中，垫上一片湿润的滤纸，接入10头 初孵2h内的幼虫，盖上盖子后用封口膜封闭培养皿，防止幼虫逃逸。每个转化体设置 3个重复的处理组，每次生物测定实验以相同生长期的非转基因植物作为阴性对照。5 天后，统计每个实验组中幼虫的存活头数，计算出幼虫的死亡率。根据统计得到的死 亡率数据，筛选出高抗水稻害虫的转基因株系，结果如表9所示。

64、表9水稻转化体对鳞翅目害虫的生物活性(死亡率)测定

65、

66、

67、注：*表达cry1ab-vip3af蛋白的水稻转化体；**表达cry1ab-vip3ag蛋白的水稻转化体；oc2，表达cry1ab蛋白的水稻转化体；ck，对照组非转基因水稻。

68、通过本实施例描述的方法，筛选出7个具有高抗水稻害虫活性、植株表现型与非转基因株系接近的抗虫水稻转化体。对获得的转化体进行草地贪夜蛾的生物活性测 定，杀虫率为100％，与本课题组前期获得的表达cry1ab蛋白的水稻转化体oc2相比， 生物活性显著提高。

69、最后，以上列举的仅是本发明的若干实施例。显然，本发明不限于以上实施例， 还可以有许多延伸和拓展。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接到导出 或联想到的所有延伸，均应认为是本发明的保护范围。