一种用于构建膀胱癌类器官的培养基及其培养方法与流程

10mm、alk5抑制剂 0.5μm、n-feruloyloctopamine 4μm、n-acetylcysteine 1.25mm、penicillin/streptomycin/amphotericin b 100iu/ml、wnt 3a 200ng/ml、r-spondin-1 250ng/ml、noggin 150ng/ml、fgf-7 25ng/ml、fgf-10 10ng/ml、fgf-2 12.5ng/ml、betacellulin 30ng/ml以及b27 0.5x。
7.进一步地，alk5抑制剂为a83-01。
8.进一步地，基础培养基为advanced dmem/f12。
9.一种用于构建膀胱癌类器官的培养基的制备方法，包括以下步骤：将上述添加因子加入至基础培养基中混合均匀即可。
10.一种膀胱癌类器官的培养方法，包括以下步骤：（1）对膀胱癌患者尿液进行处理，然后收集肿瘤细胞；（2）将步骤（1）收集的肿瘤细胞与基质胶混合重悬，然后接种，再静置至凝固，然后加入预热后的上述培养基进行培养即可。
11.进一步地，步骤（1）中对膀胱癌患者尿液进行处理的过程如下：（1）于1000~1200rpm条件下对收集的膀胱癌患者尿液离心10~15min，收集细胞沉淀；（2）将细胞沉淀放入离心管中，使用dpbs-ps进行清洗，反复涮洗至清洗液澄清即可；（3）再加入dpbs-ps对细胞进行重悬，然后过100~200μm的细胞筛网，并于1000~1500rpm条件下离心5~10min后，收集细胞。
12.进一步地，步骤（2）中接种量为50μl/滴，培养基的预热温度为37℃。
13.进一步地，在加入预热后的上述培养基后，每2-4天更换一次培养基，培养7-14天后进行传代培养。
14.进一步地，在步骤（1）收集细胞后，如若样本中含有较多红细胞（细胞沉淀呈现红色），则需加入1-2 ml红细胞裂解液进行裂红，具体过程为：使用1 ml的枪头上下吹打几次，冰上孵育10min，若细胞沉淀体积小于100 μl，使用1 ml红细胞裂解液，若大于100 μl，需使用2 ml红细胞裂解液，然后于1500 rpm，离心5 min，收集细胞。
15.进一步地，步骤（2）中在37℃环境下静置凝固。
16.一种膀胱癌类器官，采用上述方法培养得到。
17.上述膀胱癌类器官在药物筛选中的应用。
18.本发明的有益效果：1、本发明对于肿瘤患者身体无创伤，并且可重复性强，可以提高膀胱癌类器官的增殖速度和膀胱癌类器官培养的成功率。
19.2、本发明有利于临床普遍开展膀胱癌肿瘤筛查以及治疗，有利于节省医疗资源和患者治疗成本，有助于改善患者的预后生活质量以及心理健康水平。
20.3、本发明是专门用于膀胱癌类器官培养的培养基，能够有效的建立膀胱癌类器官以及对其长期的维持培养和扩增，实现膀胱癌类器官的快速稳定生长。
21.4、本发明在培养基中添加了marsalyl，mersalyl作为一种缺氧诱导因子1（hif-1）诱导剂，能够显著诱导eno1 mrna的表达。与此同时，在培养基设计过程中，发现如果在培养基中再加入pi3k/akt通路激动剂sy-lb-35，其能够与marsalyl一同显著促进膀胱癌类器官
的生长与增殖，并且，根据实验可以确定，两者具有良好的协同增效作用。
附图说明
22.图1为本发明实施例1的人膀胱癌类器官培养图一；图2为本发明实施例1的人膀胱癌类器官培养图二；图3为本发明实施例2的人膀胱癌类器官培养图一；图4为本发明实施例2的人膀胱癌类器官培养图二；图5为本发明实施例3的人膀胱癌类器官培养图一；图6为本发明实施例3的人膀胱癌类器官培养图二；图7为本发明对比例1的人膀胱癌类器官培养图一；图8为本发明对比例1的人膀胱癌类器官培养图二；图9为本发明对比例2的人膀胱癌类器官培养图一；图10为本发明对比例2的人膀胱癌类器官培养图二；图11为本发明对比例3的人膀胱癌类器官培养图一；图12为本发明对比例3的人膀胱癌类器官培养图二；图13为本发明对比例4的人膀胱癌类器官培养图一；图14为本发明对比例4的人膀胱癌类器官培养图二；图15为本发明对比例5的人膀胱癌类器官培养图一；图16为本发明对比例5的人膀胱癌类器官培养图二；图17为本发明对比例6的人膀胱癌类器官培养图一；图18为本发明对比例6的人膀胱癌类器官培养图二。
具体实施方式
23.下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
24.实施例1本实施例提供一种构建膀胱癌类器官的培养基及其培养方法，该培养基成分和各组分浓度如下表1所示：表1 培养基成分和各组分浓度
采用上述培养基培养膀胱癌类器官的具体过程如下：（1）收集膀胱癌患者尿液，于1200rpm离心10min，收集细胞沉淀。
25.（2）将细胞沉淀收集放入15ml离心管中，使用dpbs-ps（含1%三抗的dpbs）进行清洗，反复涮洗至清洗液澄清，约5-10次。
26.（3）加入2 ml dpbs-ps对细胞进行重悬，过100 μm的细胞筛网，1500rpm，离心5min，收集细胞。
27.（4）小心地倒出并丢弃上清液，避免接触到细胞沉淀。
28.（5）当样本含有较多的红细胞（细胞沉淀呈现红色）时，加入1-2 ml红细胞裂解液进行裂红。首先使用1 ml的枪头上下吹打几次，冰上孵育10min，细胞沉淀体积小于100 μl，再使用1 ml红细胞裂解液，若大于100 μl，则需使用2 ml红细胞裂解液，然后于1500 rpm，离心5 min，收集细胞。
29.（6）将获取的细胞沉淀细胞计数后重悬于基质胶中，以50μl/滴进行接种，接种完成后，将培养板在37℃下静置30分钟以待基质胶完全凝固。
30.（7）使用移液枪沿着孔侧壁向每个孔中轻轻地加入500 μl于37℃预热的膀胱癌类器官培养基，再使用dpbs-ps进行封边处理。
31.（8）每3天更换一次培养基，根据实际情况，培养至7-14天时进行传代培养，并观察培养情况；其中，当培养至第5天时，加入2-3ml tryple express（life technologies，12605-010）消化酶，将培养的膀胱癌类器官进行消化5min，加入5ml dpbs（biological industries，02-023-1acs）终止消化，1200rpm，3min离心，用1ml类器官培养基重悬，并采用细胞计数仪进行计数。
32.采用上述方法最终培养得到的膀胱癌类器官见图1和图2，如图1（4x）和图2（20x）
所示，采用本技术方法培育得到的类器官形成数量多，活性良好。
33.实施例2本实施例提供一种构建膀胱癌类器官的培养基及其培养方法，膀胱癌类器官的培养方法同实施例1，培养基各组分浓度采用最低端点值，培养基成分如下表2所示：表2 培养基成分和各组分浓度采用上述方法最终培养得到的膀胱癌类器官如图3（4x）和图4（20x）所示，采用本技术方法培育得到的类器官形成数量良好，活性良好。
34.实施例3本实施例提供一种构建膀胱癌类器官的培养基及其培养方法，膀胱癌类器官的培养方法同实施例1，培养基各组分浓度采用最高端点值，培养基成分如下表3所示：表3 培养基成分和各组分浓度
采用上述方法最终培养得到的膀胱癌类器官如图5（4x）和图6（20x）所示，采用本技术方法培育得到的类器官形成数量良好，活性良好。
35.对比例1本对比例提供患者新鲜膀胱癌组织建立膀胱癌类器官模型，培养方式以及所用培养基成分均与实施例1保持相同。具体过程如下：1、将样本转移到一个3.5 cm培养皿中，尽量清除脂肪组织和正常组织，仅保留病灶。
36.2、将样本放入15ml离心管中，使用dpbs-ps进行清洗，反复涮洗至清洗至清洗液澄清，约5-10次。
37.3、除去dpbs-ps，加入少量消化液1(masteraim
tm
组织消化液ⅰ），用剪刀将样本剪切至1 mm3的大小，直至切碎的组织块看起来比较均一，继续加入4ml消化液1 (masteraim
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组织消化液ⅰ），在5% co2，37℃的摇床中消化1h，加入8 ml dpbs-ps 终止消化，1500 rpm，离心5 min，弃上清后加入2ml消化液2 (masteraim
tm
组织消化液ⅱ），继续在5% co2，37℃的摇床中消化20min，消化结束后，加入4 ml dpbs-ps终止消化，1500 rpm，离心5 min，收集细胞。
38.4、加入2 ml dpbs-ps对细胞进行重悬，过100 μm的细胞筛网，1500 rpm，离心5 min，收集细胞。
39.5、当样本含有较多红细胞（细胞沉淀呈现红色）时，加入1
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2 ml红细胞裂解液进行裂红。具体过程为：使用1 ml的枪头上下吹打几次，冰上孵育10min，若细胞沉淀体积小于100 μl，使用1 ml红细胞裂解液，若大于100 μl，需使用2 ml红细胞裂解液，1500 rpm，离心5 min，收集细胞。
40.6、将获取的细胞沉淀细胞计数后重悬于基质胶中，以50μl/滴进行接种，接种完成后，将培养板在37℃下静置30分钟以待基质胶完全凝固。
41.7、使用移液枪沿着孔侧壁向每个孔中轻轻地加入500 μl于37℃预热的膀胱癌类器官培养基，使用dpbs-ps进行封边处理。
42.8、每3天更换一次培养基，根据实际情况，培养至7-14天时进行传代培养，并观察培养情况；其中，当培养至第5天时，加入2-3ml tryple express（life technologies，12605-010）消化酶，将培养的膀胱癌类器官进行消化5min，加入5ml dpbs（biological industries，02-023-1acs）终止消化，1200rpm，3min离心，用1ml类器官培养基重悬，并采用细胞计数仪进行计数。
43.采用上述方法最终培养得到的膀胱癌类器官见图7（4x）和图8（20x），如图7和图8所示，类器官形成数量较少，活性良好。
44.对比例2本对比例提供肿瘤患者腹水建立膀胱癌类器官模型，培养方式以及所用培养基成分均与实施例1保持相同，培养方法同实施例1。
45.采用上述方法最终培养得到的膀胱癌类器官见图9（4x）和图10（20x），如图9和图10所示，类器官形成数量少，活性良好。
46.对比例3本对比例提供肿瘤患者前列腺切除组织建立膀胱癌类器官模型，培养方式以及所用培养基成分均与实施例1保持相同，培养方法同对比例1。
47.采用上述方法最终培养得到的膀胱癌类器官见图11（4x）和图12（20x），如图11和图12所示，类器官形成数量较少，活性良好。
48.对比例4本对比例提供的培养基中省略mersalyl，培养模型和培养方法同实施例1。
49.采用上述方法最终培养得到的膀胱癌类器官见图13（4x）和图14（20x），如图13和图14所示，用此培养基进行培养的膀胱癌类器官生长较为缓慢，数量较少。
50.对比例5本对比例提供的培养基中省略sy-lb-35，培养模型和培养方法同实施例1。
51.采用上述方法最终培养得到的膀胱癌类器官见图15（4x）和图16（20x），如图15和图16所示，用此培养基进行培养的膀胱癌类器官生长状态较差，类器官数量较少。
52.对比例6本对比例提供的培养基中的pi3k/akt通路激动剂sy-lb-35替换为licarin b，培养模型和培养方法同实施例1。
53.采用上述方法最终培养得到的膀胱癌类器官见图17（4x）和图18（20x），如图17和图18所示，用此培养基进行培养的膀胱癌类器官生长较为缓慢，类器官较小。
54.分别对实施例1~3和对比例1~6培养种胶阶段和培养至第五天时进行细胞计数，结果见表4和表5。
55.表4 种胶阶段细胞计数
表5 培养至第五天时细胞计数注：以细胞浓度8万/滴胶作为铺板标准。
56.如表4和表5的检测数据可知，使用从尿液中收集而来的肿瘤细胞建立的膀胱癌类器官与使用亲本肿瘤组织建立的类器官相比，活力更高，且增殖速度更快。
57.根据上述记载可知，收取膀胱癌患者尿液中的肿瘤细胞建立类器官模型，可以作为临床治疗膀胱癌患者的药物筛选模型，同时提高类器官建立效率和增殖速度，对病人进行无创且多次检测有助于临床医生跟踪胰腺癌病程发展，改善患者预后生活质量具有重大意义。
58.在设计的培养基中，以实施例1为标准，在培养基中加入marsalyl和sy-lb-35之后，结果表明同时添加marsalyl和sy-lb-35两种生长因子，有利于膀胱癌类器官的生长与增殖。