植物乳植杆菌发酵转化三七皂苷R1制备稀有皂苷的方法

植物乳植杆菌发酵转化三七皂苷r1制备稀有皂苷的方法
技术领域
1.本发明涉及益生菌发酵技术领域，具体涉及植物乳植杆菌发酵转化三七皂苷r1制备稀有皂苷的方法。


背景技术：

2.三七panax notoginseng(burk.)f. h. chen为五加科植物，以干燥根及根茎入药，别名山膝、金不换，是我国的传统珍贵中药，具有滋补、强壮、补血、消肿镇痛、止血散癖等作用。皂苷是三七根中主要的活性成分之一，其中含量最高的三种皂苷分别为三七皂苷r1、人参皂苷re和人参皂苷rg1。药理研究显示，这些皂苷对防治心脑血管疾病具有良好的药理活性，此外，还具有降血脂、降血糖、降血压、抗炎症、抗疲劳、耐缺氧、抗衰老和提高机体免疫力等功能。
3.目前，对三七根中皂苷成分的结构转化方法已有较多研究，其中包括酸水解、微波辅助降解等方法，这些方法转化的特异性低，反应剧烈，且反应溶液会对环境造成大量污染，不利于工业生产。也有学者使用细菌、真菌等微生物对三七根总皂苷进行生物转化，例如黑曲霉菌、链霉菌、冠突散囊菌等，以上实验均能够得到人参皂苷rh1、人参皂苷rg3、人参皂苷ck等稀有人参皂苷，但这些菌种的安全性有待商榷，其中不乏有对人体有害的致病菌，显著降低产品的安全性。
4.目前，缺乏采用乳酸菌发酵转化制备稀有皂苷，尤其是三七皂苷t5及其异构体的报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种利用植物乳植杆菌发酵转化三七皂苷r1制备三七皂苷t5及其异构体的方法，使得所述方法能够以三七根提取的三七皂苷r1为原料，获得高含量的稀有三七皂苷t5及其异构体。
6.本发明的植物乳植杆菌发酵转化三七皂苷r1制备稀有皂苷的方法，该方法具体为：步骤一、菌悬液制备将植物乳植杆菌（lactiplantibacillus plantarum）s165接种于液体mrs培养基，在温度为37～45℃的条件下静置培养16～25 h，然后离心收集菌体沉淀；灭菌水悬浮沉淀，使得活菌数为1.0
×
109～1.0
×
10
10
cfu/ml，获得菌悬液；步骤二、每1l的液体发酵培养基中接种10-30ml步骤一的菌悬液，在温度为37～42℃的条件下静置发酵7～14天；发酵结束后，发酵产物减压浓缩，冷冻干燥，干燥产物甲醇萃取，离心，上清减压回收溶剂后冷冻干燥，即得所述的三七皂苷t5及其异构体；所述的液体发酵培养基由浓度为20-50 g/l的葡萄糖、浓度为10-30 g/l的酵母浸粉和浓度为1-5g/l的三七皂苷r1组成，ph=6.0-7.0；
所述的植物乳植杆菌（lactiplantibacillus plantarum）s165，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉市武汉大学，保藏日期：2022年06月02日，保藏编号：cctcc no: m 2022783。
7.进一步地，步骤一中离心条件为：4000～8000rpm离心5～10min。
8.进一步地，步骤二中所述的发酵产物减压浓缩是在70℃条件下减压浓缩。
9.进一步地，步骤二中所述的离心是在4℃温度、10000rpm转速的条件下离心15min。
10.本发明的一株植物乳植杆菌，它为植物乳植杆菌（lactiplantibacillus plantarum）s165，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉市武汉大学，保藏日期：2022年06月02日，保藏编号：cctcc no: m 2022783。
11.本发明的一株植物乳植杆菌的应用，所述的植物乳植杆菌用于制备三七皂苷t5及其异构体。
12.进一步地，所述的植物乳植杆菌用于制备三七皂苷t5及其异构体，所述的制备三七皂苷t5及其异构体是将三七皂苷r1发酵转化为三七皂苷t5及其异构体。
13.本发明的一株植物乳植杆菌得到的用于制备三七皂苷t5及其异构体的菌剂。
14.乳酸菌是一类安全的食品级微生物，在生长的过程中，能够产生葡萄糖苷酶、鼠李糖苷酶、木糖苷酶等次生代谢产物，而这些代谢产物，能够通过切断人参皂苷的各类糖苷键并使其降解，来达到改变人参皂苷化学结构的目的。并且由于不同的乳酸菌代谢的糖苷酶的种类不同，使其对于人参皂苷的结构修饰具有显著的特异性，而不同化学组成的稀有皂苷与生物活性间存在明显的构效关系。本发明基于上述研究发现，筛选得到一株植物乳植杆菌（lactiplantibacillus plantarum）s16，并将其用于三七皂苷的发酵转化研究中，取得了显著的效果。
15.本发明包含以下有益效果：本发明的植物乳植杆菌（lactiplantibacillus plantarum）s165具有高产β-葡萄糖苷酶的特性，以此发酵转化，能够有效将三七皂苷r1转化为三七皂苷t5及其异构体。
16.本发明筛选获得1株能将三七皂苷r1发酵转化为三七皂苷t5（ng-t5）及其异构体（ng-t5 isomer）的乳杆菌新菌株，对菌株进行了鉴定，确定了菌株发酵转化制备稀有三七皂苷的工艺，采用hplc法和lc/mc法对转化的稀有三七皂苷进行鉴定。该方法具有安全、高效、成本低廉等优点。制备的稀有三七皂苷，用途广泛，应用前景广阔。
附图说明
17.图1为三七皂苷r1标准品hplc色谱图；图2为三七皂苷t5标准品hplc色谱图；图3为采用植物乳植杆菌发酵三七皂苷r1发酵后生成稀有皂苷三七皂苷t5（ng-t5）及其异构体（ng-t5 isomer）的hplc色谱图；图中a为三七皂苷t5（ng-t5）峰，b为三七皂苷t5异构体（ng-t5 isomer）峰；图4为本发明稀有三七皂苷生物转化合成路线图。
具体实施方式
18.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面将详细叙述本发
明所揭示内容的精神，任何所属技术领域技术人员在了解本发明内容的实施例后，当可由本发明内容所教示的技术，加以改变及修饰，其并不脱离本发明内容的精神与范围。
19.本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
20.实施例1 菌株的分离、鉴定和保藏一、菌株的分离分离菌株用样品及来源：2018年6月采集东北自然发酵酸菜样品。将采集的样品研磨、梯度稀释后，涂布于乳杆菌选择性固体培养基平板，于37℃培养48h，挑取平板上的典型菌落（乳白色、圆形、边缘整齐、凸起、不透明、表面湿润光滑），划线培养mrs琼脂平板，分离得到纯菌落。纯培养的菌种接种到液体mrs培养基培养，然后加入60％甘油，-80℃冰箱保存。将其中1株乳杆菌命名为s165。
21.二、菌株的鉴定s165的生理生化鉴定结果：革兰氏染色阳性，过氧化氢酶试验阴性，联苯胺试验阴性，吲哚试验阴性，乙酰甲基甲醇试验阳性；不水解淀粉，不液化明胶，不产生硫化氢，发酵葡萄糖产酸不产气；不运动的杆菌；在15℃和45℃能够生长，最适生长温度37～42℃；适宜ph为5.0～7.0；耐受6.5％ nacl；s165在液体mrs培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀。
22.上表中，“+”表示菌株为阳性反应；
“‑”
表示菌株为阴性反应。
23.16s rdna基因序列扩增和比对。采用ctab法提取基因组dna，根据基因序列的保守区域分别设计16s rdna引物，进行pcr扩增和产物测序后，通过blast将获得菌株16s rdna序列与genbank库中已知菌株的序列信息进行同源性比对分析，鉴定待测菌株；以16s rdna序列同源性大于99%为标准进行属种归类。将16s rdna序列通过blast程序在genbank数据库（genbank登录号为：genbank/aj965482）中进行同源性比对分析，发现s165与植物乳植杆菌的同源性大于99%。
[0024] 根据以上结果，菌株s165被鉴定为植物乳植杆菌（lactiplantibacillus plantarum）。
[0025]
三、菌株的保藏本发明的植物乳植杆菌（lactiplantibacillus plantarum）s165，已于2022年06
月02日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称cctcc，地址为：中国武汉市武汉大学，保藏日期：2022年06月02日，保藏编号：cctcc no: m 2022783。
[0026] 实施例2 植物乳植杆菌（lactiplantibacillus plantarum）s165产糖苷酶活性检测植物乳植杆菌（lactiplantibacillus plantarum）s165接种于液体mrs培养基中，37℃静置培养16h，4℃、6000rpm离心8min，收集上清液，作为酶活检测的样品。
[0027] 采用酶分析试剂盒测定β-葡萄糖苷酶对对硝基苯-β-d-葡萄糖苷(pnpg)的水解速率。使用100mm pbs（ph 7.0）配置5mm的pnpg，分别吸取500μl添加至5ml样品中，在37℃下孵育30 min后，加入250μl冷0.2 m碳酸钠(4℃)终止反应，用eppendorf离心机在14000
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g条件下离心30 min，通过0.45 μm膜过滤器过滤。用分光光度计在420 nm处测定对硝基酚的释放量。每毫升每分钟从底物水解产生1 μmol对硝基酚的能力，定义为一个酶活力单位。
[0028] 表2 植物乳植杆菌（lactiplantibacillus plantarum）s165产糖苷酶活性 实施例3 本发明的稀有皂苷制备一、植物乳植杆菌（lactiplantibacillus plantarum）s165菌悬液的制备植物乳植杆菌（lactiplantibacillus plantarum）s165（以下均用s165表示）接种于液体mrs培养基（购买得到），37℃静置培养16h，4℃、6000rpm离心8min，收集菌体沉淀，用发酵灭菌培养基水溶液悬浮，调整活菌数为1.0
×
10
9 cfu/ml，获得s165菌悬液。
[0029]
三七皂苷r1（hplc≥98%）购买自成都埃法生物科技有限公司。
[0030] 发酵转化方法：液体发酵培养基包括葡萄糖30g/l，酵母浸粉10g/l，ph6.6，121℃灭菌15min。液体培养基中三七皂苷r1的添加量为1g/l，并按10ml/l接种植物乳植杆菌菌悬液，37℃，静置发酵14天。发酵结束后，发酵产物低温（70℃）减压浓缩，冷冻干燥，干燥产物甲醇萃取，离心（10000rpm，15min，4℃），上清减压回收溶剂后冷冻干燥。
[0031] 实施例4 本发明的三七稀有皂苷t5的鉴定1、hplc检测稀有三七皂苷：将三七皂苷r1发酵液冻干，甲醇溶解，经0.22μm微孔滤膜过滤后用于色谱分析。
[0032]
hplc色谱分析方法：色谱柱为agilent pursuit5 sb-c18色谱柱，进样量20μl，流速1ml/min，柱温30℃，检测波长203nm。流动相为a：水，b：乙腈，0~40min 18~21%(b)；40~42min 21~26%(b)；42~46min 26~32%(b)；46~66min 32~34%(b)；66~71min 34~38%(b)；71~77.70min 38.0~49.1%(b)；77.70~82min 49.1%(b)；82~83min 49.1~50.6%(b)；83~88min 50.6~59.6%(b)；88~89.80min 59.6~65.0%(b)；89.80~97min 65%(b)；97~102min 65~75%(b)；102~110min 75~85%(b)；110~115min 85%(b)；115~125min 85~18%(b)；125~130min 18.0%(b)。
[0033] 三七皂苷r1和t5标准品分别如图1和2所示。三七皂苷r1发酵后生成稀有皂苷三七皂苷t5（ng-t5）及其异构体（ng-t5 isomer）的hplc色谱见图3。稀有三七皂苷生物转化合成路线为图4，三七皂苷r1在植物乳植杆菌s165产生的葡萄糖苷酶的作用下水解生成三七皂苷r2，再进一步转化生成三七皂苷t5（ng-t5）及其异构体（ng-t5 isomer）。三七皂苷t5
（ng-t5）hplc色谱条件下的保留时间与标准品保留时间一致，三七皂苷t5（ng-t5）及其异构体（ng-t5 isomer）质谱分析结果化合物的分子量均为751.46，上述结果确定三七皂苷r1经植物乳植杆菌s165发酵转化后生成稀有皂苷三七皂苷t5（ng-t5）及其异构体（ng-t5 isomer）。