紫花苜蓿叶面积相关的SNP分子标记组合及应用

紫花苜蓿叶面积相关的snp分子标记组合及应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及紫花苜蓿叶面积相关的snp分子标记的开发及其应用。


背景技术：

2.苜蓿作为以收获茎叶营养体为主的牧草，叶片对苜蓿产草量的贡献率达30%~60%。同时叶中蛋白含量远高于茎，而且对饲草品质有重要的影响。因此，研究苜蓿叶面积大小对提高苜蓿产量和品质方面有一定的潜力，对促进高产、优质苜蓿生产有重要意义，选育叶面积大，叶量丰富、叶茎比高的苜蓿新品种一直是育种工作者追求的目标。
3.随着基因工程的发展，越来越多的科研工作者开始探索与叶片相关的基因，从而获得叶面积性状较为突出的苜蓿品种，以取代传统的通过采集叶片、观察评价叶片大小等形态指标来进行品种筛选或选育。
4.目前，cn107384939b公开了一种mtunusual floral organs基因在调控小叶数量和叶茎比中的应用，其目的是通过基因工程改造直接提高苜蓿小叶片数量，从而获得高产优质苜蓿新品系，然而紫花苜蓿是同源四倍体（2n=4x=32），异花授粉植物，具有高杂合度和自交不亲和性，其遗传背景复杂，通过一种基因难以对大量苜蓿群体单株进行与叶面积相关的品质性状的筛选。因此，从单个基因的角度筛选与叶面积性状相关的苜蓿优良品种仍面临较大的挑战。


技术实现要素：

5.为了实现高效、快速、精准的筛选叶面积性状相关的苜蓿优异种质材料，从而提高高产优质苜蓿新品种的选育效率，加速育种进程。本技术以叶片大小上有显著差异的紫花苜蓿为亲本材料，通过杂交获得f1代群体，，对亲本及其f1后代的叶面积进行多年的表型鉴定分析，采用基因组重测序技术完成了亲本及f1代群体的基因型分析，通过qtl定位，获得了16~61个snp组合，为利用分子标记辅助选择培育叶片大、产量高且品质优良的苜蓿新品种奠定基础。
6.为实现本发明的技术目的，本发明第一方面提供一种与紫花苜蓿叶面积相关的snp分子标记组合，所述snp分子标记组合由表1所示的16个snp组成：表1
进一步的，所述snp分子标记组合为表2所示61个snp组成：表2
为实现本发明的技术目的，本发明第二方面提供一种分析紫花苜蓿叶面积性状的方法，将待测苜蓿的基因组dna的snp位点基因型与对照苜蓿的基因组dna的所述的位点基因型进行比较；其中，所述snp位点为表2所示的snp位点组合。
7.为实现本发明的技术目的，本发明第三方面提供一种分析紫花苜蓿叶面积性状的分子探针组合，其检测第一方面所述的snp分子标记组合或第二方面所述的snp分子标记组合。
8.为实现本发明的技术目的，本发明第四方面提供一种分析紫花苜蓿叶面积的基因芯片，其具有第一方面或第二方面所述的snp分子标记组合或第三方面所述的snp分子探针标记组合。
9.为实现本发明的技术目的，本发明第五方面提供一种分析紫花苜蓿叶面积的试剂盒，其具有第一方面所述的snp分子标记组合或第三方面所述的snp分子探针标记组合或第四方面所述的基因芯片。
10.为实现本发明的技术目的，本发明第六方面提供一种分析紫花苜蓿叶面积的方
法，应用第一方面或第二方面所述的snp分子标记组合或第三方面所述的snp分子探针标记组合或第四方面所述的基因芯片或第五方面所述的试剂盒待测样品进行检测。
11.为实现本发明的技术目的，本发明第七方面提供上述snp分子标记组合或上述的分子探针组合或上述的基因芯片或上述的试剂盒在检测紫花苜蓿叶面积中的用途，其具有如下任一所述的用途：（1）在苜蓿叶面积性状评价中的应用；（2）在苜蓿叶面积性状相关品种鉴定中的应用；（3）在苜蓿叶面积性状相关品种种质资源保护中的应用；（4）在苜蓿叶面积性状相关品种种质资源改良中的应用；（5）在苜蓿叶面积性状相关品种筛选的应用；（6）在苜蓿叶面积性状相关品种育种中的应用。
附图说明
12.图1是父母本植株叶片表型照片；图2是叶片大小频率分布图，其中a-e分别为2018年昌平，2019年昌平，2018廊坊，2019廊坊，2020廊坊环境；图3是苜蓿叶片大小qtl在父本遗传连锁群上的分布情况；图4是苜蓿叶片大小qtl在母本遗传连锁群上的分布情况；图5父母本遗传连锁图谱，p1为父本遗传图谱，p2为母本遗传图谱；图6 转录组数据对定位的qtl位点的验证，其中，图6a是转录组数据分析鉴定筛选结果，图6b是基因分析与表型相关性分析结果。
具体实施方式
13.试验基地基本情况：本发明的田间试验是在中国农业科学院 (万庄) 国际农业高新技术产业园基地（河北省廊坊市）和中国农业科学院北京畜牧兽医研究所昌平畜禽综合试验基地（北京市昌平区）进行，其中，中国农业科学院 (万庄) 国际农业高新技术产业园基地（河北省廊坊市）基地位于河北省中部偏东，n39.59
°
，e116.59
°
，属于暖温带大陆性季风气候，四季分明。年平均气温为11.9℃左右，最冷月份是在每年的1 月份，平均气温仅为
‑ꢀ
4.7℃，最热月份在每年的7 月，平均气温高达26.2℃。每年的平均降水量为554.9 mm 。四个季节的降水量不均匀，主要降水集中在夏季。每年的平均日照在2660 h以上。供试土质为中性土壤，有机质含量为1.69%，ph 值7.37。中国农业科学院北京畜牧兽医研究所昌平畜禽综合试验基地（北京市昌平区）基地位于北京市西北部，n40.18
°
，e116.24
°
，属暖温带，半湿润大陆性季风气候。春季干旱多风，夏季炎热多雨，秋季凉爽，冬季寒冷干燥，四季分明。年平均气温11.8℃，最冷月（1月）平均气温为-4.6℃，最热月（7月）平均气温为25.8℃。年平均降水量550.3 mm，年平均日照时数为2684 h。
14.实施例1亲本材料的选择及群体样本选择叶片差异较大、产量差异较大的两个苜蓿品种的单株作为两个亲本材料。
15.具体的，本发明选择叶片小、产量低的紫花苜蓿为父本，选择叶片大且产量高的紫花苜蓿为母本，在本发明的一个实施例中，采用沧州苜蓿为父本，中苜1号为母本，根据图1所示母本与父本的叶片照片可以明显看出，二者的叶片大小差异显著。
16.将父本与母本杂交产生的f1种子于2015年在中国农业科学院 (万庄) 国际农业高新技术产业园基地温室培养。温室处理为16 h光照、8 h黑暗，其中光照强度（自然光和白炽灯光组合）大约为200 μmol/m
2 ·
s；温度为22℃，相对湿度为40%。通过扦插获得亲本和子代的无性繁殖株系，在2016年早春，各移栽3份植株材料到中国农业科学院 (万庄) 国际农业高新技术产业园基地和中国农业科学院北京畜牧兽医研究所昌平畜禽综合试验基地田间种植，共3个重复，每个重复都包括1个父母本和388个f1代个体进行统计分析。实验采用完全随机区组设计，行间距1 m，植株间距0.8 m。扦插后生长至初花期前刈割两次，确保植株的生长一致性，之后再进行植株表型的测定。
17.表型数据采集及分析于2018、2019和2020三年对基地中的群体进行叶型数据采集，包括叶长、叶宽和叶面积。每年在5月份初始花期完成对叶型的测定与统计，具体测定方法可以采用本领域常规方法中的任一一种，在本发明的一个实施例中，本发明使用lam-b型手持叶面积仪进行植株叶片长和宽的测定，叶面积根据利用叶面积仪给出的公式计算得出。为了使表型数据更具有代表性，减少误差，本发明具体采集叶片的位置为植株不同的三个枝条从上往下数第三茎节或第四茎节上的顶生小叶，每个植株挑选三片叶片。
18.利用sas 9.4软件进行表型数据基本统计分析和方差分析，利用rstudio绘制正态分布图和遗传力的计算，利用qtl icimapping软件中aov功能计算blup值（best linear unbiased prediction，最佳线性无偏预测）。
19.表型数据统计和分析结果显示父本和母本叶长均值分别为2.58 cm和4.26 cm，叶宽分别为1.25 cm和2.17 cm，叶面积分别为2.37 cm2和6.79 cm2，可见母本植株的叶长、叶宽和叶面积均大于父本，且存在显著性差异（p《 0.01）（如图1及表3所示）。可见，父本与母本的表型从统计学上差异显著。
20.表3叶长、叶宽和叶面积性状的相关性分析注：***代表0.001水平上有差异。
21.在f1后代群体中，叶长变化幅度为0.80-4.90 cm，叶宽的变化幅度为0.30-2.90 cm，叶面积范围是0.44-10.04 cm2，后代存在明显的超亲分离。同时分析了叶长、叶宽和叶面积的遗传力分别为65%，71%和69%，如表4所示，说明这些性状主要受遗传因素影响，受环境影响较小。
22.表4亲本和f1子代叶片大小的统计分析
注：环境用地点+年份来表示，cp指的是昌平，lf指的是廊坊；α指的是18年，β指的是19年，γ指的是20年。**代表0.05水平上有显著异。
23.同时发现叶长、叶宽和叶面积的偏度和峰度绝对值多数小于1，可见三个表型性状在五个环境中基本呈连续正态分布，如图2所示，可见，叶长、叶宽和叶面积是由多基因控制的典型数量性状。
24.通过对叶长、叶宽和叶面积之间的相关性分析，如表5所示，可见，这3个性状之间均呈现极显著的正相关关系（p《 0.001）。其中，叶长与叶面积的相关系数为0.90，叶宽与叶面积的相关系数为0.95。
25.表5叶长、叶宽和叶面积性状的方差分析根据以上分析结果可知，紫花苜蓿叶片的表型主要受遗传因素的影响，因此本发明采用叶片表型差异较大的父母本及其子代群体作为数据来源可以更好的获得能够分析苜蓿叶面积大小的snp分子标记组合。
26.分子标记的获得a.基因分型及遗传图谱的构建采集父母本和f1后代群体中每个单株的幼嫩叶片100mg，利用cwbio植物基因组dna试剂盒提取植物基因组dna，具体提取方法参照手册说明进行。用nanodrop 2000分光光度计在260nm的吸光度下对dna进行了定量。将dna浓度调整到50 ng/
µ
l，得到苜蓿植株的dna溶液，制作gbs文库。
27.用ecot221限制性内切酶切dna，在illumina hi-seq2000测序平台对gbs文库进行测序，在cornell university测序仪器上进行100碱基双端测序，利用tassel 3.0软件完成snp calling和基因分型。将f1子代中分离比小于2：1的sda（single-dose alleles，单剂量等位基因）视为sda标记，而f1子代中缺失值小于50%的sda将会被用于连锁图谱构建。连锁图谱分群及排图利用joinmap 4.0软件进行分析，将筛选到的snp标记导入joinmap 4.0软件中，以lod = 3为标准构建苜蓿遗传连锁图谱，得到苜蓿遗传连锁图谱，得到基因分型结果及遗传图谱，如图5所示。
28.b.表型数量性状位点的定位（以下简称qtl定位）利用构建的遗传连锁图谱进行qtl定位，其中父本连锁图谱包含32个连锁群，944个snp标记，图谱总长4088.70 cm，标记间的平均遗传距离4.33 cm；母本连锁图谱包含32个连锁群，2874个snp标记，图谱总长4229.15 cm，标记间的平均遗传距离1.5 cm。
29.具体定位方法为：用qtl icimapping 4.1软件进行qtl初定位，选择完备区间作图中的icim-add和icim-epi模型，分别以lod 》 3和lod 》 5为阈值，进行qtl加性效应和上位性效应的检测，利用mapchart 2.3软件绘制qtl加性效应在连锁群上的分布图。最终获得如表6所示的16个主效qtl，及表7所示的45个其他qtl，一共61个qtl，即61个snp位点。
30.在本发明的一个实施例中，将表型变异解释率（phenotypicvariationexplained，pve）大于10%的qtl称为主效qtl。
31.表616个主效qtl16个主效qtl表745个其他qtl
根据表6及表7可以看出，与叶长相关的qtl共有21个，其中父本连锁群上有7个，母本连锁群上有14个。父本连锁群定位的qtl解释的表型变异为3.96%-16.43%，贡献率大于5%的qtl有3个位于7d染色体上，分别为qll-7d-1、qll-7d-2和qll-7d-3，其中后两个qtl共定位在同一区间（52 cm处），解释的表型变异分别为14.78%，16.43%。母本连锁群定位的14个qtl解释的表型变异为3.41%-14.53%，贡献率大于5%的qtl有5个，其中4个位于6d染色体上，1个位于7a染色体上。位于6号染色体上的3个qtl qll-6d-4，qll-6d-5和qll-6d-6）共定位于40 cm处，解释的表型变异分别为10.10%、5.56%和14.53%。
32.与叶宽相关的qtl共有20个，其中父本连锁群上有4个，母本连锁群上有16个。父本连锁群定位的qtl解释的表型变异为9.19%-20.28%，贡献率均大于5%，而且4个qtl均位于7d
染色体上，分别为qlw-7d-1、qlw-7d-2、qlw-7d-3和qlw-7d-4，其中后3个qtl共定位在同一区间（57 cm处），贡献率最高的为qlw-7d-4（解释的表型变异为20.28%）。母本连锁群定位的16个qtl解释的表型变异为3.75%-18.86%，贡献率大于5%的qtl有13个，其中位于3d染色体上的qlw-3d-1、qlw-3d-2，共定位于26 cm处，解释的表型变异为5.04%-5.48%；位于6a染色体上的qlw-6a-1、qlw-6a-2，共定位于12 cm处，解释的表型变异为5.68%-6.68%；位于6b染色体上的qlw-6b-1、qlw-6b-2，共定位于24 cm处，解释的表型变异为5.92%-7.91%；此外，在6d染色体上定位了5个qtl，分布于14-28 cm区间，对表型变异的贡献率超过了8%，最高达到18.86%。
33.与叶面积相关的qtl共有20个，其中父本连锁群上有5个，母本连锁群上有15个。父本连锁群定位的qtl解释的表型变异为3.38%-11.39%，贡献率最大的是位于7d连锁群上的qla-7d（11.39%）；母本连锁群定位的15个qtl中有9个解释的表型变异大于5%，其中有8个分布于6d染色体上，而且有两个共定位于27 cm处，其中qla-6d-3对表型变异的贡献率最高。
34.实施例2共定位区域分析除分析共定位区域外，其他均与实施例1相同。
35.通过分析与叶长、叶宽和叶面积相关qtl的分布区域，发现共定位区域的qtl共有11个，如表8所示，其中，叶长与叶宽共定位的区间有2个：分别是qll-6d-1和qlw-6d-2共定位于母本6d染色体19cm处，qll-7d-2、qll-7d-3和qlw-7d-1共定位于父本7d染色体52cm处，父本遗传图谱上与叶长和叶面积相关的qla-4a-1和qll-4a-1共定位于父本4a染色体79cm处，以及qla-4a-2和qll-4a-2共定位于父本4a染色体侧翼标记tp13527-tp67107区间内；母本遗传图谱上与叶长和叶面积相关的qll-6d-4、qll-6d-5、qll-6d-6和 qla-6d-6共定位于母本6d染色体40 cm处，qla-8c和qll-8c-2共定位于母本8c染色体90cm处；叶宽与叶面积共定位的区间有3个：分别为qla-3d、qlw-3d-1和qlw-3d-2共定位于母本3d染色体26cm处，qlw-5d和qla-5d共定位于母本5d染色体侧翼标记tp100802-tp72212区间内，qla-6d-1和qlw-6d-3共定位于母本6d染色体25cm处；此外，与叶长、叶宽和叶面积同时定位的qtl区间有2个：分别为qll-6d-2、qlw-6d-4、 qla-6d-2和qla-6d-3共定位于母本6d染色体27cm处，qll-6d-3，qlw-6d-5、qla-6d-4和qla-6d-5共定位于母本6d染色体28 cm处，且都解释了较高的表型变异，如图3及图4所示。
36.表8父母本上共定位的qtl
试验例1转录组分析对qtl位点的验证对中苜1号苜蓿叶组织进行了转录组测序，通过对转录组数据分析鉴定了与叶片发育相关的基因共2443个。此外，结合苜蓿基因组数据库分析了qtl区间内的基因，鉴定了该区间内有1573个基因，其中分布在qtl的区间内有29个基因是转录组数据分析的结果中与叶片发育相关的基因，如图6a所示。我们对苜蓿不同组织中这29个基因进行了qrt-pcr分析，结果表明有四个与叶片发育相关的基因在叶组织中的表达量显著升高，而且与定位的qtl位点相对应，进一步证实这4个qtl位点可以用于鉴定苜蓿叶片发育的标记，这四个基因可以作为苜蓿叶片发育选育的候选基因。这四个基因分别分布于不同的qtl区间内，其中qla-7d-1区间的候选基因为ms.gene08405, qlw-6d-5 and qla-6d-4 区间的候选基因为ms.gene05412, qlw-6d-2, qla-6d-1, and qla-6d-2 区间内的候选基因为ms.gene66562, qll-6d-1, qll-6d-2, and qll-6d-3区间的候选基因为 (ms.gene30313) ，如图6b所示。
37.应用实施例1snp位点组合分析苜蓿叶面积性状从苜蓿群体中随机选择96株苜蓿单株作为待测苜蓿样品，提取样品基因组dna。
38.采用primer5.0引物设计软件，根据表1和表2中的qtl的左右侧标记序列分别设计引物，测序公司合成引物。
39.将设计的引物到pcr的反应体系中，每个反应体系总体积为5μl，其中5ng样品基因组dna，0.25 μm引物，1
×
master mix，终体积达到5 μl，最后加10 μl的矿物油。
40.pcr反应程序：95℃变性2 min；然后94℃、30秒、57℃(退火温度可根据实际设置)、30秒，45个循环，运行结束后4℃保存，得到pcr扩增产物。
41.pcr扩增产物被转移到高分辨率溶解曲线（hrm）分析系统中进行检测。hrm分析系统可以采用市售的任一一种，例如lightscanner型号、lightcycler480型号、rotor-gene6000型号等，在本发明的实施例中还可以使用其他效果优异的基因分型分析系统，本发明不作限制。
42.pcr扩增产物经仪器校准器校准后获得峰值读数，获得基因型结果，确定所标记的单碱基突变位点。
43.结果发现，本实施例检测了96个样本中与叶长、叶宽和叶面积相关snp位点，结果表明，约75%的样本中出现了相关的位点突变，以与相关qtl位点qll6d-1、qla6d-4、qlw6d-5
为例，其中右侧变异位点为c/t，对pcr产物测序分析显示，所选样本被分成两个类型，基因型分别为cccc、tttc，其中一个碱基c/t发生突变；高分辨率溶解曲线（hrm）结果如图5所示。进一步对取样单株的叶片表型分析显示，结果显示不同样品间cp含量具有较大的差异，具有snp突变位点的单株叶面积有增高的趋势。
44.应用实施例2基因分析苜蓿叶面积大小从筛选到的候选基因中，挑选了6d染色体上的ms.gene53334基因进行验证，从苜蓿育种群体中随机挑选60个单株，采用rt-pcr技术对候选基因的表达量进行定量分析，实验结果表明，候选基因表达量较高的单株其叶片的表型也表现出增大的趋势，大约有68.5%的单株其表达量高，而叶片也相对较大。
45.应用实施例3snp位点组合分析苜蓿叶面积性状采用primer5.0引物设计软件，根据表1中的qtl的左右侧标记序列分别设计引物组一，根据表1和2中的qtl的左右侧标记序列分别设计引物组二，测序公司合成引物。
46.将设计的引物组一和引物组二加入到两个pcr的反应体系中，每个反应体系总体积为5μl，其中5ng样品基因组dna（与应用实施例1提供的dna相同），0.25 μm引物，1
×
master mix，终体积达到5 μl，最后加10 μl的矿物油。
47.pcr反应程序：95℃变性2 min；然后94℃、30秒、57℃(退火温度可根据实际设置)、30秒，45个循环，运行结束后4℃保存，得到pcr扩增产物。
48.对pcr扩增产物进行分型分析后，根据表4显示的每个位点的贡献率对加入引物组一的分型结果进行计算，并进行分类，结果显示除编号m3-9、m17、19、m38-45、m53-57、m60-60的叶面积小于阈值（本发明采用实施例1中f1代的叶面积平均值为阈值，即3.85cm2）外，其他均为叶面积性状较优的苜蓿品种，其中，叶面积较大的苜蓿品种约占样本总量的75%，这与应用实施例1中的实验结果显示的约75%的样本中出现了相关的位点突变的结果一致。
49.根据表4及表5显示的每个位点的贡献率对加入引物组二的分型结果进行计算，并进行分类，结果显示除编号m3-9、m17、19、m38-45、m53-57、m60-60的叶面积小于阈值外，其他均为叶面积性状较优的苜蓿品种，其中，叶面积较大的苜蓿品种约占样本总量的75%，这与应用实施例1中的实验结果显示的约75%的样本中出现了相关的位点突变的结果一致同时采集96株苜蓿单株初花期的叶面积数据，通过统计分析发现，编号为m3-9、m17、19、m38-45、m53-57、m60-60的植株的叶面积均小于其他编号，这与基因分析结果一致，可见，利用表1及表2供的qtl均可以对苜蓿叶面积性状进行筛选和分类。
50.需要说明的是，本领域技术人员还可以根据本发明提供的表1及表2的qtl及其贡献值进行权重、大数据等计算，但是只要根据本发明提供的qtl及其贡献值计算获得苜蓿叶面积分析结果或对苜蓿品种进行筛选或对苜蓿品种进行分类，均属于本发明的保护范围。