一株枯草芽孢杆菌及其应用和产品的制作方法

1.本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一株枯草芽孢杆菌及其应用和产品。


背景技术：

2.副溶血性弧菌(vibrio parahaemolyticus,vp)广泛存在于海水和海产品中,是我国沿海地区常见的食物中毒病原菌，已知副溶血性弧菌有12种o抗原及59 种k抗原，据其发酵糖类的情况可分为5个类型，各种弧菌对人和动物均有较强的毒力，其致病物质主要有分子量42000的致热性溶血素(tdh)和分子量48000的tdh类似溶血毒(trh)，具有溶血活性、肠毒素和致死作用。
3.副溶血性弧菌不仅会对虾、鱼类、贝类和其他甲壳类等海水养殖生物造成危害，而且人类进食了这些含有副溶血性弧菌的食物会导致副溶血性弧菌食物中毒，副溶血性弧菌食物中毒临床上以急性起病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状，主要病理变化为空肠及回肠有轻度糜烂，胃粘膜炎、内脏(肝、脾、肺)淤血等，因此，抑制副溶血弧菌的活性对水产动物和人体具有重要意义。
4.目前，副溶血性弧菌的防治一般采用细菌素和消毒剂等化学类药物治疗，但药物残留和抗药性易造成环境污染，给人类带来危害。随着微生态制剂的发展，微生态制剂因其具有绿色环保、无毒副作用、无残留污染等优点，使其成为细菌素和消毒剂最有潜力的替代品。微生态制剂(probioties)，也叫活菌制剂 (bigone)或生菌剂，是指运用微生态学原理，利用对宿主有益无害的益生菌或益生菌的促生长物质，经特殊工艺制成的制剂，微生态制剂能够促进正常微生物群生长繁殖和抑制致病菌生长繁殖，目前微生态制剂己被应用于饲料、农业、医药保健和食品等各领域中。芽孢杆菌类细菌具有抗逆性好，生长迅速，适应能力强大能够产生丰富多样的抗菌物质等优点，是一种理想的用于抑制副溶血性弧菌的微生态制剂，但是现有公开的芽孢杆菌类细菌对副溶血性弧菌的抑菌率较低，而且耐高温性能较差，经过高温处理后容易失活，导致抗菌活性大大下降。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提出一株枯草芽孢杆菌，该菌为枯草芽孢杆菌bacillussubtilis b-1158，已于2021年12月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏单位地址：中国广州，保藏编号为gdmcc no.62165，本发明的枯草芽孢杆菌对副溶血弧菌具有优异的抑菌活性且具有耐高温的特点，能够解决现有芽孢杆菌类细菌对副溶血性弧菌的抑菌率低和耐高温性能较差的问题。
6.本发明的另一目的在于提出一种水产用抑菌产品，能有效抑制副溶血性弧菌和多种水产养殖治病菌。
7.本发明的又一目的在于提出一种水产用净水产品，能够有效降解养殖水体的有机质，从而达到净化水体的效果。
8.本发明的再一目的在于提出一种水产用护肝保健产品，通过复配菌粉、复合中药、
年12月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmccno.62165。
25.具体来说，本技术方案中的枯草芽孢杆菌bacillus subtilis b-1158(简称 bsw)分离于虾塘池底淤泥中，该菌株16s rdna序列全长共1390bp，将bsw 样品16 s rdna序列在ncbi(https://b last.ncbi.nlm.nih.gov)上比对发现：bsw 样品与bacillus subtilis的同源性达到99.86％，结合其菌落形态(如图1所示) 鉴定该菌株为bacillus subtilis，并命名为bacillus subtilis b-1158，已于2021年 12月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称：gdmcc，地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮政编码：510070)，保藏编号为gdmcc no.62165。
26.值得说明的是，本技术方案中的枯草芽孢杆菌具有抑菌活性，能够抑制副溶血弧菌、霍乱弧菌、迟钝爱德华氏菌、温和气单胞菌以及嗜水气单胞菌，其中，本技术方案的枯草芽孢杆菌对副溶血弧菌具有优异的抑菌活性，而且，本方案的枯草芽孢杆菌的抑菌能力具有耐高温的特点，bsw的发酵液经过80℃高温处理后，抑菌活性能保持90％左右，经过100℃的高温处理后，抑菌活性依然能保持70％左右，基于bsw在饲料或饲料添加剂范畴内的使用，可能会涉及高温制粒的生产工艺，bsw抑菌活性的耐高温特性，使其比其他菌株更适合高温制粒，使用范围更广。同时，由于bsw是从虾塘池底淤泥中分离出来的细菌，属于虾塘养殖环境中的土著细菌，对养殖生态的适应性更强，使得bsw及含有bsw的的产品，能够适应养殖水体的复杂环境，起效更快。由此可见，采用本技术方案的枯草芽孢杆菌制成抑菌产品，用于水产养殖行业，能有效抑制副溶血弧菌的生长繁殖，避免副溶血弧菌对虾、鱼类、贝类和其他甲壳类等海水养殖生物造成危害，从而能保护海水养殖生物和人体的安全。
27.具体来说，本技术方案的枯草芽孢杆菌在一定的条件下可以形成芽孢，芽孢具有较强的抗逆性，能耐受较高温度，芽孢率高的菌株能够提高菌粉干燥过程中的细菌存活率，本技术方案的枯草芽孢杆菌的芽孢率在90％以上，从而使得bsw具有耐高温的特点。
28.值得指出的是，本技术方案的枯草芽孢杆菌的分离方法包括以下步骤：
29.(1)从虾塘池底淤泥中取出适量样品，经过梯度稀释以后，分别涂布在 na固体培养基和mrs培养基上，其中，na培养基置于37℃中培养，mrs培养基置于厌氧袋中37℃培养，培养16～18小时后，根据菌落形态进行分离并得到候选菌株。
30.(2)将候选菌株用na液体培养基培养24小时后，取上清液进行抑菌圈检测(以副溶血弧菌为指示菌)，抑菌圈直径最大的候选菌株即为枯草芽孢杆菌。
31.进一步的说明，枯草芽孢杆菌在制备抑制副溶血性弧菌的产品中的应用。
32.通过在抑制副溶血性弧菌的产品加入枯草芽孢杆菌(可以是活菌或干燥后的菌粉)，能够有效抑制副溶血性弧菌，避免副溶血性弧菌危害海水养殖生物和人体的健康，本技术方案中抑制副溶血性弧菌的产品可以是抑菌剂、微生态制剂、饲料或者是饲料添加剂等等。
33.一种水产用抑菌产品，含有上述的枯草芽孢杆菌。
34.值得说明的是，本技术方案的枯草芽孢杆菌能够抑制副溶血弧菌、霍乱弧菌、迟钝爱德华氏菌、温和气单胞菌以及嗜水气单胞菌等水产致病菌的生长与繁殖，和降解养殖水体中的有机质；提高水产养殖动物的免疫力。通过在水产用抑菌产品中添加枯草芽孢杆菌能够有效抑制副溶血弧菌和其他水产致病菌的活性，从而能确保水产养殖动物健康生长，达到提高水产养殖动物的产量和保护人体健康的效果。
35.进一步的说明，水产用抑菌产品的制备方法如下：将枯草芽孢杆菌和培养基配制成扩培包，得到水产用抑菌产品。
36.具体来说，水产用抑菌产品的制备方法如下：将适量的培养基和bsw菌粉 (干燥后得到)配制成扩培包，即得水产用抑菌产品，在使用的时候，直接在水产用抑菌产品中加水然后进行曝气活化4～5小时即可拌料喂养使用。
37.优选的，水产用抑菌产品中所使用的培养基为实施例2中的发酵培养基1、发酵培养基2和发酵培养基3中的任意一种。
38.一种水产用净水产品，按质量份数，水产用净水产品包括枯草芽孢杆菌 15～25份、乳酸菌15～25份、地衣芽孢杆菌15～25份和滑石粉25～55份，其中，枯草芽孢杆菌为上述的枯草芽孢杆菌。
39.值得说明的是，bsw不仅能起到抑菌作用，而且还能产淀粉酶和蛋白酶，同时，地衣芽孢杆菌能够产生多种消化酶，如蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶等，bsw 和地衣芽孢杆菌能够产生的多种消化酶，能够有效降解养殖水体的有机质，从而达到净化水体的效果，同时，在水产用净水产品中加入乳酸菌，由于乳酸菌是厌氧菌，能够适应接近池塘底部的低氧环境，通过枯草芽孢杆菌、乳酸菌和地衣芽孢杆菌的复配作用，能达到更好的净水效果，将本技术方案的水产用净水产品泼水使用后即可起净化水体的效果，通过实验证明，未使用水产用净水产品前的养殖水体的透明度约15cm，使用后两天透明度提高至20cm左右，由此可见，本技术方案的水产用净水产品能有效增加养殖水体的透明度，达到净化水体的效果，同时，本技术方案的水产用净水产品还能抑制多种水产致病菌，保护水产养殖动物。
40.具体来说，水产用净水产品中所用的枯草芽孢杆菌、乳酸菌和地衣芽孢杆菌均为菌粉。
41.优选的，按质量份数，水产用净水产品包括枯草芽孢杆菌20份、乳酸菌20 份、地衣芽孢杆菌20份和滑石粉40份。
42.进一步的说明，水产用净水产品的制备方法如下：将配方将枯草芽孢杆菌、乳酸菌、地衣芽孢杆菌和滑石粉均匀混合，得到水产用净水产品。
43.值得说明的是，本技术方案的水产用净水产品的制备方法简单，制备成本低，只需要将各原料混合均匀便可。
44.具体来说，在使用本技术方案的水产用净水产品时，由于水产用净水产品中使用的枯草芽孢杆菌、乳酸菌和地衣芽孢杆菌均为菌粉，处于芽孢状态(休眠体)，因此，在使用时，需要向水产用净水产品中加水和红糖进行曝气活化 4～5小时，通过水和红糖活化，使得枯草芽孢杆菌、乳酸菌和地衣芽孢杆菌从休眠体中苏醒，活化后泼水使用即可起净化水体的效果。
45.具体的，在活化中，水产用净水产品、水、红糖的质量比为1：5：94。
46.一种水产用护肝保健产品，按质量份数，包括复配菌粉45～75份、复合中药15～25份、抗菌肽5～15份和酵母核苷酸5～15份；
47.按质量份数，复配菌粉包括枯草芽孢杆菌15～25份、乳酸菌15～25份和地衣芽孢杆菌15～25份，其中，所述复合菌粉中的枯草芽孢杆菌为上述的枯草芽孢杆菌。
48.进一步的说明，复合中药包括丹参、黄芪、枸杞和五味子。
49.值得说明的是，本技术方案的水产用护肝保健产品中的抗菌肽和枯草芽孢杆菌均
具有抑菌作用，能够抑制水产养殖动物肠道中有害细菌，改善肠道健康，水产养殖动物的消化系统健康，对肝脏的负荷相对减少；同时，乳酸菌能够抑制肠道有害细菌，与抗菌肽复配使用，效果更好，地衣芽孢杆菌能够产生多种消化酶(如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等)，有助于水产养殖动物的消化吸收，且水产用护肝保健产品中的复合中药包括丹参、黄芪、枸杞和五味子多种中药，复合中药具有疏肝理气，清肝明目的作用；酵母核苷酸能够加速肠道细胞的分化、生长和修复，还具有极好的抗氧化作用，能够有效维护肝脏的正常功能，本技术方案的水产用护肝保健产品通过复配菌粉、复合中药、抗菌肽和酵母核苷酸多种组分的协同作用，从而能达到达到保肝保健作用。
50.具体来说，酵母核苷酸可从市面上直接购买得到，神域湖北海宜生物科技有限公司，型号yt500。
51.进一步是说明，本方案的水产用护肝保健产品的制备方法如下：按配方，将复配菌粉、复合中药、抗菌肽和酵母核苷酸混合均匀，即可得到水产用护肝保健产品。
52.优选的，按质量份数，水产用护肝保健产品中包括复配菌粉60份、复合中药20份、抗菌肽10份和酵母核苷酸10份。
53.优选的，复合中药中丹参、黄芪、枸杞和五味子的质量比为1：1：1：1。
54.实施例1
55.本实施例中枯草芽孢杆菌的分离和筛选如下：
56.(1)从虾塘池底淤泥中取出适量样品，经过梯度稀释以后，分别涂布在 na固体培养基和mrs培养基上，其中，na培养基置于37℃中培养，mrs培养基置于厌氧袋中37℃培养，培养18小时后，根据菌落形态进行分离并得到候选菌株。
57.(2)将候选菌株用na液体培养基培养24小时后，取上清液进行抑菌圈检测(以副溶血弧菌为指示菌)，抑菌圈直径最大的候选菌株即为枯草芽孢杆菌。
58.具体的，本实施中枯草芽孢杆菌的16s rdna序列分析结果如下所示：该菌株16 s rdna序列全长共1390bp，将bsw样品16 s rdna序列在ncbi (https://b last.ncbi.nlm.nih.gov)上比对发现：bsw样品与bacillus subtilis的同源性达到99.86％，结合其菌落形态(如图1所示)鉴定该菌株为bacillus subtilis，并命名为bacillus subtilis b-1158，已于2021年12月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称：gdmcc，地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼 5楼，邮政编码：510070)，保藏编号为gdmcc no.62165。
59.实施例2
60.枯草芽孢杆菌的发酵方法：挑取bsw单菌落接种到lb培养基上，37℃， 180rpm培养10小时后作为种子液，将种子液分别接种到表1所示的三种配方的发酵培养基中，接种后于37℃和180rpm的条件下培养24小时，培养完成后开始进行镜检，记录芽孢形成时间并检测数据，实验数据如下表2所示。
61.表1发酵培养基的配方
[0062][0063]
表2采用三种发酵培养基进行发酵的实验数据
[0064][0065]
具体的，从表2的实验数据可知，采用表1所示的三种发酵培养基进行发酵，均可以使枯草芽孢杆菌形成芽孢，且枯草芽孢杆菌采用这三种发酵培养基进行发酵的芽孢率均在90％以上，特别是使用发酵培养基2进行发酵时，枯草芽孢杆菌的芽孢率达到99.03％，芽孢具有较强的抗逆性，能耐受较高温度，芽孢率高的菌株能够提高菌粉干燥过程中的细菌存活率，本技术方案中bsw的芽孢率在90％以上，使得bsw具有优异的耐高温性能。
[0066]
枯草芽孢杆菌的耐高温性能检测，操作方法如下：将上述采用三种发酵培养基进行发酵后得到的bsw发酵液，分别在80℃和100℃的温度下进行高温处理后，检测活菌数，检测数据如下表3所示：
[0067]
表3枯草芽孢杆菌的耐高温性能检测数据
[0068][0069]
从表3的检测数据可知，采用三种发酵培养基进行发酵后得到的bsw发酵液经过80℃高温处理后，细菌存活率均大于90％；经过100℃的高温处理后，细胞存活率依然能保持70％以上，由此可见，本方案的枯草芽孢杆菌具有耐高温的特点，通过高温处理后bsw的细胞存活率较高，使得bsw经过高温处理后依然能保持较好的抗菌活性。
[0070]
实施例3
[0071]
枯草芽孢杆菌(bsw)的抑菌能力验证，采用牛津法进行抑菌试验，具体操作如下：将已灭菌的未凝固的lb固体培养基倒在培养皿内，每皿30ml，待其凝固后，用移液枪吸取100μl由指示菌(副溶血弧菌、霍乱弧菌、迟钝爱德华氏菌、温和气单胞菌以及嗜水气单胞菌)制备的最佳指示浓度的菌液，用无菌涂布棒涂布均匀；在无菌条件下，将已灭菌的牛津杯(牛津杯的尺寸：内径6mm、外径8mm、高10mm)垂直放在lb固体培养基的表面；在牛津杯中加入100μl待测样品(bsw发酵液)，于37℃，180rpm培养24h，测量抑菌圈直径，结果如下表4所示。
[0072]
表4枯草芽孢杆菌(bsw)对致病菌的抑菌效果
[0073]
指示菌抑菌圈直径(mm)副溶血弧菌27霍乱弧菌21迟钝爱德华氏菌26温和气单胞菌18嗜水气单胞菌20
[0074]
从表4可知，枯草芽孢杆菌(bsw)对副溶血弧菌、霍乱弧菌、迟钝爱德华氏菌、温和气单胞菌以及嗜水气单胞菌均具有较好的抑菌效果，对副溶血弧菌具有更好抑菌效果，抑菌圈直径为27mm。
[0075]
实施例4
[0076]
枯草芽孢杆菌的产酶能力研究，操作方法如下：将bsw接种到培养基中(酵母浸粉1.6％、糖蜜2％)，37℃培养24小时后，取上清液检测淀粉酶和中性蛋白酶的活性，通过检测可知，淀粉酶活性为21.17u/ml，中性蛋白酶活性为459 u/ml。从上述检测结果可知，本技术方案的枯草芽孢杆菌能够淀粉酶和蛋白酶，因此将枯草芽孢杆菌用于养殖水体，能够降解养殖水体的有机质，从而达到净化水体的效果，同时，将会枯草芽孢杆菌给水产养殖动物喂
食后，不仅能达到抑制有害细菌的效果，还能有助于水产养殖动物的消化吸收。
[0077]
实施例5
[0078]
一种水产用抑菌产品的制备方法如下：将枯草芽孢杆菌和培养基配制成扩培包，得到水产用抑菌产品，其中，培养基为实施例2中的发酵培养基2。
[0079]
具体的，在使用本实施例的水产用抑菌产品时，直接在水产用抑菌产品中加水曝气活化4～5小时即可拌料喂养使用。
[0080]
实施例6
[0081]
一种水产用净水产品，按质量份数，包括枯草芽孢杆菌20份、乳酸菌20 份、地衣芽孢杆菌20份和滑石粉40份，其中，枯草芽孢杆菌为bacillus subtilisb-1158(简称bsw)，其中，本实施例水产用净水产品中所用的枯草芽孢杆菌、乳酸菌和地衣芽孢杆菌均为菌粉，按现有常规的菌粉制备方法便可制备得到。
[0082]
本实施例水产用净水产品的制备方法如下：将配方将枯草芽孢杆菌、乳酸菌、地衣芽孢杆菌和滑石粉均匀混合，得到水产用净水产品。
[0083]
具体来说，本实施例的水产用净水产品的使用方法如下：向水产用净水产品中加水和红糖进行曝气活化5小时，通过水和红糖活化，使得枯草芽孢杆菌、乳酸菌和地衣芽孢杆菌从休眠体中苏醒，活化后泼水使用即可起净化水体的效果，其中，在活化时水产用净水产品、水、红糖的质量比为1：5：94。
[0084]
具体的，将本实施例制得的水产用净水产品投入到水产养殖池塘中，水产养殖池塘的面积为0.5亩，平均水深1.1米，在投入实施例制得的水产用净水产品检测水产养殖池塘的透明度为15cm，将水产用净水产品投入到水产养殖池塘中，两天后透明度提高至21cm，由此可见，本实施例的水产用净水产品能有效增加养殖水体的透明度，达到净化水体的效果。
[0085]
实施例7
[0086]
一种水产用护肝保健产品，按质量份数，包括复配菌粉60份、复合中药 20份、抗菌肽10份和酵母核苷酸10份；其中，复配菌粉包括枯草芽孢杆菌 (bsw)20份、乳酸菌20份和地衣芽孢杆菌20份；复合中药包括丹参5份、黄芪5份、枸杞5份和五味子5份。
[0087]
本实施例水产用护肝保健产品的制备方法如下：按配方，将复配菌粉、复合中药、抗菌肽和酵母核苷酸混合均匀，即可得到水产用护肝保健产品。
[0088]
以上结合具体实施例描述了本发明的技术原理。这些描述只是为了解释本发明的原理，而不能以任何方式解释为对本发明保护范围的限制。基于此处的解释，本领域的技术人员不需要付出创造性的劳动即可联想到本发明的其它具体实施方式，这些方式都将落入本发明的保护范围之内。