一种实用型小球藻培养基及其制备方法

1.本发明涉及小球藻培养基领域，特别涉及一种实用型小球藻培养基及其制备方法。


背景技术：

2.当随着水产养殖集约化发展，养殖过程中的残留饵料和养殖生物的排泄物对水体造成污染，并使得养殖水体富营养化。小球藻(chlorella sp.)是一类光能自养型生物，在光照条件下利用co2作为碳源，吸收利用养殖废水中的溶解态营养盐进行产物合成与自身生长，在藻细胞内部合成蛋白质、多糖、油脂等物质，并释放出氧气为养殖生物利用。小球藻自身营养丰富是养殖动物的优质生物饵料，将小球藻应用于养殖水的生物净化处理，具有操作简便，污染物去除效率高等优点，可有效安全地改善养殖水环境、减少病害发生、提高养殖水产动物品质，具有积极的生态环境意义。


技术实现要素：

3.鉴于此，本发明的目的在于提出一种实用型小球藻培养基的制备方法，解决上述问题。
4.本发明的技术方案是这样实现的：
5.一种实用型小球藻培养基，每升培养基包括以下组分：大量元素水溶肥0.5-1.0g，微量元素水溶肥0.25-0.5g，无水醋酸钠0.26-0.5g，土壤浸出液1-2ml，波罗蜜叶提取物1-2ml，牛耳枫叶提取物1-2ml和余量水。
6.进一步的，所述土壤浸出液制备方法为：称取小苏打，溶于水中，制得小苏打水，取土壤加入小苏打水中，搅拌1-3min，浸泡15-25min，用8层纱布过滤，取上清液，制得土壤浸出液。
7.进一步的，所述波罗蜜叶提取物的制备方法为：采摘波罗蜜叶子洗净晒干，粉碎，过80-100目筛网，制得波罗蜜叶粉，将波罗蜜叶粉和乙醇溶液混合，密封浸泡45-50小时，间隔8小时搅拌一次，浸泡提取完用600目纱布过滤，静置1.5-2.5小时，取上清液，制得波罗蜜叶提取物。
8.进一步的，所述牛耳枫叶提取物制备方法为：采摘牛耳枫叶洗净晒干，粉碎，过80-100目筛网，制得牛耳枫叶粉，将牛耳枫叶粉和乙醇溶液混合，密封浸泡45-50小时，间隔8小时搅拌一次，浸泡提取完用600目纱布过滤，静置1.5-2.5小时，取上清液，制得牛耳枫叶提取物。
9.进一步的，所述小球藻包括蛋白核小球藻和普通小球藻。
10.进一步的，所述制备方法包括以下步骤：
11.(1)取水煮沸，冷却至室温备用；
12.(2)量取总用量1/2的水，将大量元素水溶肥、微量元素水溶肥、无水醋酸钠加入水中，搅拌混合，制得混合溶液1；
13.(3)将土壤浸出液、波罗蜜叶提取物、牛耳枫叶提取物加入混合溶液1中，补足水，制得实用型小球藻培养基。
14.进一步的，所述小苏打和水的质量体积比为4.0-4.5g:1l，所述小苏打水和土壤的质量比为4.5-5.5:1。
15.进一步的，所述波罗蜜叶粉和乙醇溶液料液质量比为1:17-23，所述乙醇溶液质量浓度为60-80％。
16.进一步的，所述牛耳枫叶粉和乙醇溶液料液质量比为1:18-22，所述乙醇溶液质量浓度为60-80％。
17.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
18.本发明的实用型小球藻培养基中营养全面，大量元素水溶肥为通用型园艺植物复合肥料富含氮、磷、钾元素，微量元素水溶肥富含硝态氮、钙、镁、硼、锌、铁、锰等元素，无水醋酸钠提供碳源，土壤浸出液中含有较为丰富的矿物质、微量元素等，可促进小球藻快速生长，成分简单易得，适用于热带地区广大养殖户。本发明中发现在此基础上加入波罗蜜叶提取物和牛耳枫叶提取物对细菌和寄生虫有很强的抑制作用，可有效减少小球藻培养过程中杂菌和寄生虫污染，维持水体ph值，既能提供养分促进小球藻生长，还可提高养殖动物的免疫能力。波罗蜜叶和牛耳枫叶提取物是热带地区常见食材，成本低廉，广大养殖户有能力制备使用。
附图说明
19.图1实施例2小球藻培养效果图
20.图2实施例5小球藻培养效果图
21.图3对比例2小球藻培养效果图
22.图4对比例4小球藻培养效果图
具体实施方式
23.为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
24.本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
25.本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
26.本发明实施例所使用的大量元素水溶肥为史丹利牌家庭园艺肥，总养分(n+p2o5+k2o)≥60％。
27.本发明实施例所使用的微量元素水溶肥为绿盾牌全水溶微量元素肥，钙≥13％、镁≥6.0％、硼+锌+铁+锰+铜+钼≥0.4％。
28.所述土壤浸出液制备方法为：称取4.2g小苏打，溶于1l自来水中，取200g土壤加入小苏打水中，搅拌2min，浸泡20min，用8层纱布过滤，取上清液，得土壤浸出液。
29.所述波罗蜜叶提取物的制备方法为：采摘波罗蜜叶子洗净晒干，粉碎，过100目筛网，制得波罗蜜叶粉，将波罗蜜叶粉和乙醇溶液混合，所述波罗蜜叶粉和乙醇溶液料液质量比为1:20，所述乙醇溶液质量浓度为70％，密封浸泡48小时，间隔8小时搅拌一次，浸泡提取完用600目纱布过滤，静置2小时，取上清液，制得波罗蜜叶提取物。
30.所述牛耳枫叶提取物制备方法为：采摘牛耳枫叶洗净晒干，粉碎，过100目筛网，制
得牛耳枫叶粉，将牛耳枫叶粉和乙醇溶液混合，所述牛耳枫叶粉和乙醇溶液料液质量比为1:20，所述乙醇溶液质量浓度为70％，密封浸泡48小时，间隔8小时搅拌一次，浸泡提取完用600目纱布过滤，静置2小时，取上清液，制得牛耳枫叶提取物。
31.实施例1
32.称取以下组分：大量元素水溶肥0.5g，微量元素水溶肥0.25g，无水醋酸钠0.25g，土壤浸出液1.0ml。
33.实施例2
34.称取以下组分：大量元素水溶肥1.0g，微量元素水溶肥0.5g，无水醋酸钠0.5g，土壤浸出液2.0ml。
35.实施例1-2培养基的制备方法为：
36.(1)取水煮沸，冷却至室温备用；
37.(2)取500ml水，依次称取大量元素水溶肥、微量元素水溶肥、无水醋酸钠加入水中，每加入一种试剂均充分搅拌溶解，量取土壤浸出液加入水中，搅拌均匀，补充水至1l，用600目筛网过滤溶液中的不溶固体，即制小球藻培养基。
38.实施例3
39.牛耳枫粉的制备方法为采收5～6个月果龄的牛耳枫叶鲜果对半切开，晒干，粉碎，过80-100目筛网，制得牛耳枫粉。
40.波罗蜜叶粉的制备方法为取波罗蜜叶洗净晒干，粉碎，过80-100目筛网，制得波罗蜜叶粉。
41.称取以下组分：大量元素水溶肥1.0g，微量元素水溶肥0.5g，无水醋酸钠0.5g，土壤浸出液2.0ml，波罗蜜叶粉1.0g，牛耳枫粉1.0g。
42.培养基的制备方法为：
43.(1)取水煮沸，冷却至室温备用；
44.(2)取500ml水，依次称取大量元素水溶肥、微量元素水溶肥、无水醋酸钠、波罗蜜叶粉、牛耳枫粉加入水中，每加入一种试剂均充分搅拌溶解，用600目筛网过滤溶液中的不溶固体，量取土壤浸出液加入水中，搅拌均匀，补充水至1l，即制小球藻培养基。
45.实施例4
46.称取以下组分：大量元素水溶肥1.0g，微量元素水溶肥0.5g，无水醋酸钠0.5g，土壤浸出液2.0ml，波罗蜜叶提取物1.0ml，牛耳枫叶提取物1.0ml。
47.实施例5
48.称取以下组分：大量元素水溶肥1.0g，微量元素水溶肥0.5g，无水醋酸钠0.5g，土壤浸出液2.0ml，波罗蜜叶提取物2.0ml，牛耳枫叶提取物2.0ml。
49.实施例4-5培养基的制备方法：
50.(1)取水煮沸，冷却至室温备用；
51.(2)取500ml水，依次称取大量元素水溶肥、微量元素水溶肥、无水醋酸钠加入水中，每加入一种试剂均充分搅拌溶解，用600目筛网过滤溶液中的不溶固体，量取土壤浸出液、波罗蜜叶提取物、牛耳枫叶提取物加入水中，搅拌均匀，补充水至1l，即制小球藻培养基。
52.对比例1
53.一种常用的小球藻培养基(水生6号)，每升培养基包括以下组分：nano3(硝酸钠)0.25g，k2hpo4·
3h2o(三水合磷酸氢二钾)0.075g，mgso4·
7h2o(七水硫酸镁)0.08g，cacl2·
2h2o(二水合氯化钙)0.05g，kh2po4(磷酸二氢钾)0.2g，nacl(氯化钠)0.025g，fecl3·
6h2o(六水三氯化铁)0.005g，土壤浸出液0.5ml。
54.培养基的制备方法为
55.(1)取水煮沸，冷却至室温备用；
56.(2)取500ml水，将上述培养基组分依次称量好加到水中搅拌溶解；加入土壤浸出液，补充水至1l，混匀，即制得小球藻培养基。
57.对比例2
58.一种常用的小球藻培养基(bg11)，每升培养基以下组分：nano3(硝酸钠)0.15g，k2hpo4·
3h2o(三水合磷酸氢二钾)0.04g，mgso4·
7h2o(七水硫酸镁)0.075g，cacl2·
2h2o(二水合氯化钙)0.036g，一水合柠檬酸0.006g，柠檬酸铁铵0.006g，edta-na20.001g，na2co3(碳酸钠)0.02g，a5(微量元素)1ml。
59.其中a5(微量元素)配方如下，每升a5包括以下组分：h3bo3(硼酸)2.86g，mncl2·
4h2o(四水氯化锰)1.81g，znso4·
7h2o(七水硫酸锌)0.22g，na2moo4·
2h2o(二水钼酸钠)0.39g，cuso4·
5h2o(五水硫酸铜)0.079g，co(no3)2·
6h2o(六水硝酸钴)0.05g。
60.培养基的制备方法，包括以下步骤：
61.(1)取水煮沸，冷却至室温备用；
62.(2)配制a5(微量元素)种子液：取500ml水，依次加入称量好的配方组分，每加一个试剂都要充分搅拌溶解，补充水至1l；
63.(3)取500ml水，将上述培养基组分依次称量好加到水中搅拌溶解；加入a5(微量元素)种子液，补充水至1l，混匀，即制得小球藻培养基。
64.对比例3
65.复合维生素储备液，按每100ml计：维生素b
1 0.1g，尼克酸0.1g，生物素1.5mg。
66.微量元素储备液，按每100ml计：七水硝酸铜0.004g，七水硫酸锌0.024g，二水钼酸钠0.075g，余量水。
67.称取以下培养基组分：nh4cl(氯化铵)0.25g，乙酸钠0.2g，mgso4·
7h2o(七水硫酸镁)0.02g，kh2po4(磷酸二氢钾)0.175g，k2hpo4·
3h2o(三水合磷酸氢二钾)0.075g，cacl2·
2h2o(二水合氯化钙)0.01g，复合维生素储备液1ml，微量元素储备液20ml，余量水。
68.培养基的制备方法，包括以下步骤：
69.(1)取水煮沸，冷却至室温备用；
70.(2)配制复合维生素储备液：取50ml水，依次加入称量好的配方组分，每加入一种试剂均充分搅拌溶解，补充水至100ml；
71.(3)配制微量元素储备液：取50ml水，依次加入称量好的配方组分，每加一个试剂都要充分搅拌溶解，补充水至100ml；
72.(4)取500ml水，将上述培养基组分依次称量好加到水中搅拌溶解；加入复合维生素储备液和微量元素储备液，补充水至1l，混匀，即制得培养基。
73.对比例4
74.波罗蜜叶水提取物的制备方法为：采摘波罗蜜叶子洗净晒干，粉碎，过100目筛网，
制得波罗蜜叶粉，将波罗蜜叶粉和无菌水混合，所述波罗蜜叶粉和无菌水料液质量比为1:20，密封浸泡48小时，间隔8小时搅拌一次，浸泡提取完用600目纱布过滤，静置2小时，取上清液，制得波罗蜜叶水提取物。
75.牛耳枫叶提取物制备方法为：采摘牛耳枫叶洗净晒干，粉碎，过100目筛网，制得牛耳枫叶粉，将牛耳枫叶粉和无菌水混合，所述牛耳枫叶粉和无菌水料液质量比为1:20，密封浸泡48小时，间隔8小时搅拌一次，浸泡提取完用600目纱布过滤，静置2小时，取上清液，制得牛耳枫叶水提取物。
76.称取以下组分：大量元素水溶肥1.0g，微量元素水溶肥0.5g，土壤浸出液2.0ml，波罗蜜叶水提物1.0g，牛耳枫叶水提物1.0g。
77.培养基的制备方法为：
78.(1)取水煮沸，冷却至室温备用；
79.(2)取500ml水，依次称取大量元素水溶肥、微量元素水溶肥、无水醋酸钠、罗蜜叶水提取物和牛耳枫叶水提取物加入水中，每加入一种试剂均充分搅拌溶解，用600目筛网过滤溶液中的不溶固体，量取土壤浸出液加入水中，搅拌均匀，补充水至1l，即制小球藻培养基。
80.试验例1
81.将上述实施例1-5和对比例1-4制得的培养基进行小球藻的培养效果比较，试验所用的小球藻为发明人从海南养殖水环境中筛选纯化的小球藻(chlorella sp.)。按比例配制培养基2l，装于5l三角瓶中，每种培养基设置三个平行，分别接种20％实验室活化的小球藻藻种，于室外自然光照条件下进行培养，每天早中晚摇藻3次，于刚接种以及培养的第24、48、96、144小时分别取样用血球计数板计算培养液中小球藻的数量和检测培养液的ph值，结果见表1、表2。
82.表1小球藻1代种在不同培养基配方中的生长情况
[0083][0084]
表2培养液ph值变化
[0085][0086]
对比例1、对比例2为小球藻大量扩培时常用培养基，从表1和表2看出，对比例1、2与实施例相比明显不利于小球藻生长，藻细胞数量低，对比例1小球藻生长速度最慢。
[0087]
对比例3为常用小球藻培养基hsm的改良版，没有添加波罗蜜叶和牛耳枫叶。对比例4无添加醋酸钠，加了波罗蜜叶水提物和牛耳枫叶水提物，从试验结果来看添加醋酸钠可以有效促进小球藻生长。
[0088]
实施例3-5和对比例4添加了波罗蜜叶和牛耳枫叶或牛耳枫鲜果的粉末或者提取物，与未加的实施例1-2和对比例1-3相比，小球藻细胞数量明显增多，且培养液ph较为稳定，在培养过程变化不大，实施例5加入波罗蜜叶提取物和牛耳枫叶乙醇提取物后小球藻的藻细胞数量为所有实施例中最高。
[0089]
综上，添加了波罗蜜叶和牛耳枫叶的试验例中，均没有明显杂菌污染现象，证明培养基中添加波罗蜜叶和牛耳枫叶能有效抑制杂菌生长，加入波罗蜜叶提取物和牛耳枫叶提取物更有利于小球藻的生长。
[0090]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。