一种醛酮还原酶及其应用

本发明涉及生物工程，更具体地说，涉及一种醛酮还原酶及其应用。

背景技术：

1、手性醇是光学活性药物、农用化学品、生物活性化合物、精细化学品和染料的工业生产的重要组成部分。α-苯乙醇又名1-苯乙醇、苏合香醇，与β-苯乙醇是同分异构体。它具有柔和、令人愉快的玫瑰香气。因此，α-苯乙醇作为食用香精广泛应用于食品添加剂。此外，α-苯乙醇作为香料也是芳香化合物中的重要原料。α-苯乙醇具有手性，其对映体均可用于合成香料或活性药物。(s)-α-苯乙醇作为重要结构单元可以用于合成(s)-舒喘宁和(s)-氟西汀等药物。因此，(s)-α-苯乙醇在合成手性化合物中具有重要的意义。

2、目前，获得(s)-α-苯乙醇的生物方法主要有：外消旋体-α-苯乙醇的酶动力学拆分和前手性苯乙酮的不对称还原。然而，酶动力学拆分因其最大理论产率为50％而在应用中受到限制。因此，前手性底物苯乙酮的不对称还原是获得(s)-α-苯乙醇的最有效方法。研究显示，来自光滑念珠菌的酮还原酶、萝芙木的perakine还原酶、茶树的短链脱氢酶和氧化葡萄糖杆菌的醛酮还原酶等用于生产手性醇(preparation of structurally diversechiral alcohols by engineering ketoreductase cgkr1.acs catalysis 2017,7(10),7174-7181；enantioselective reduction of alpha,beta-unsaturated ketones andaryl ketones by perakine reductase.org lett 2019,21(12),4411-4414；characterization of enzymes specifically producing chiral flavor compounds(r)-and(s)-1-phenylethanol from tea(camellia sinensis)flowers.food chem 2019,280,27-33；中国发明专利201810355748.1)。此外，海栖热袍菌中的醛酮还原酶能够催化醛产生相应的伯醇(thermophilic enzymes and their applications in biocatalysis:arobust aldo-keto reductase.environ technol 2010,31(10),1159-1167)。氧化葡萄糖杆菌的醛酮还原酶能够还原α-酮羰基产生相应的α-羟基羰基化合物(characterizationof two aldo-keto reductases from gluconobacter oxydans 621h capable of regio-and stereoselective alpha-ketocarbonyl reduction.appl microbiol biotechnol2010,87(4),1415-1426)。但是，在细菌中尚未发现醛酮脱氢酶能够催化苯乙酮生成(s)-α-苯乙醇。因此，在细菌中挖掘具有催化底物范围更广的醛酮脱氢酶，对(s)-α-手性醇的合成具有重要的研究意义和实际应用价值，以解决酶催化活性较弱、底物耐受性差、还原生成(s)-α-手性醇较少的问题。

技术实现思路

1、1.要解决的技术问题

2、针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种来自奇异变形杆菌(proteus mirabilis)的1个醛酮还原酶，该酶对苯乙酮具有较高的催化活性，适用于制备(s)-α-苯乙醇。

3、2.技术方案

4、本发明提供了一种新颖的醛酮还原酶，以及其在不对称还原苯乙酮合成(s)-α-苯乙醇的应用，所述醛酮还原酶的氨基酸序列如seq id no.1所示。

5、进一步的，所述醛酮还原酶的编码基因对应所述seq id no.1氨基酸序列编码基因的核苷酸序列，如seq id no.2所示；

6、任何对seq id no.2所示的核苷酸序列进行基因改造，以及同一变形杆菌种属中的核苷酸序列，均属于本发明的保护范围。

7、进一步的，所述醛酮还原酶所用的底物有2,5-二酮基-d-葡萄糖酸、3-甲基-2-戊酮、2,4-二甲基-3-戊酮、3,4-二甲基-2-环戊酮、苯乙酮、2,4-二甲基-3-戊酮、4-氯丁酸乙酯、芳香-β-腈酮。

8、一种醛酮还原酶的应用，将醛酮还原酶应用于不对称还原苯乙酮获得(s)-α-苯乙醇。

9、进一步的，醛酮还原酶应用于不对称还原苯乙酮获得(s)-α-苯乙醇的方法，包括以下步骤：

10、a1、构建反应体系：提取苯乙酮、dmso、nadph以及磷酸盐缓冲液的一种或多种通过水浴混合的方式构建反应体系；

11、a2、酶活性测定：提取步骤a1中的反应体系溶液，紧接着向其内部添加醛酮还原酶并进行分光光度测定，以测定醛酮还原酶的酶活性。

12、步骤a1混合反应温度为20-70℃，且水浴时间为10min。

13、一种醛酮还原酶的应用，将醛酮还原酶和谷氨酸脱氢酶应用于一锅法不对称还原苯乙酮。

14、进一步的，醛酮还原酶和谷氨酸脱氢酶应用于一锅法不对称还原苯乙酮的方法，包括以下步骤：

15、b1、构建反应体系：提取苯乙酮、dmso、nadp+、l-谷氨酸、磷酸盐缓冲液混合构建反应体系；

16、b2、测定(s)-α-苯乙醇的产量：提取步骤b1中的反应体系溶液，同时调节反应温度为40℃，向其内部添加醛酮还原酶和谷氨酸脱氢酶，待反应结束后，利用hplc分析(s)-α-苯乙醇的产量。

17、一种醛酮还原酶的应用，醛酮还原酶的载体构建含有醛酮还原酶和谷氨酸脱氢酶共表达重组菌株，将重组菌株应用于不对称还原苯乙酮，所述醛酮还原酶的载体为prsfduet-1、petduet-1、pcdfduet-1或pacycduet-1，表达宿主为大肠杆菌bl21(de3)。

18、进一步的，重组菌株应用于不对称还原苯乙酮的方法，包括以下步骤：

19、c1、构建重组菌株：利用醛酮还原酶的载体构建含有醛酮还原酶和谷氨酸脱氢酶共表达重组菌株，并将重组质粒转入大肠杆菌bl21感受态中；

20、c2、构建反应体系：提取苯乙酮、dmso、l-谷氨酸、磷酸盐缓冲液混合构建反应体系；

21、c3、测定(s)-α-苯乙醇的产量：提取c2中的反应体系溶液，保持反应温度为30-50℃、ph值为6.0-8.0，向其内部添加c1的感受态重组菌株，在反应10h后，利用hplc分析(s)-α-苯乙醇的产量。

22、3.有益效果

23、相比于现有技术，本发明的优点在于：

24、本发明从奇异变形杆菌(proteusmirabilis)中得到了一种醛酮还原酶，该酶可以不对称还原苯乙酮，在最佳反应条件下，100mm苯乙酮在12h内完全转化为(s)-α-苯乙醇，重组工程菌od600为15，e.e.值大于99.7％，该重组工程菌能适用于多种工业生产场景，具有重要的工业应用潜力。