一种植物花药和雌蕊特异表达启动子及其应用

本发明涉及植物基因工程，具体涉及一种植物花药和雌蕊特异表达的启动子apsp(anther and pistil specific promotor)及其应用。

背景技术：

1、基因编辑，是一种新兴的比较精确的能对生物体基因组特定目标基因进行修饰的一种基因工程技术。crispr-cas(clustered regularly interspaced short palindromicrepeats-crispr associated)系统的出现，加速了基因编辑技术的发展，广泛应用于生命科学领域。为了提高这些系统的性能，研究人员设计和开发了各种各样的crispr-cas工具，具有更广泛的目标范围、更高的效率和特异性以及更高的精度(liu et al.2022)。如何通过基因编辑技术对动植物自身的基因进行精准改造，之后再把外源crispr-cas系统切除，最后得到无任何外源基因的基因编辑动植物，这个问题是生物安全，临床安全和食品安全中普遍关心的问题。

2、潮霉素b是一种常用的抗性筛选药物，它通过干扰70s核糖体移位，导致翻译错误，从而抑制蛋白合成，最终杀死细胞。其抗性基因编码潮霉素磷酸转移酶(hygromycinphosphotransferase，hpt)，通过磷酸化潮霉素b使其丧失活性，从而实现用潮霉素筛选获得转基因阳性植物的目的。但获得转基因阳性植株后如何去除hpt基因，也是涉及生物安全性的问题。

3、cre-loxp重组系统是一种特定位点的重组酶技术，可在dna的特定位点上执行删除、插入、易位及倒位。cre/loxp系统，主要由两大组分组成：cre重组酶(cre recombinase)和一段叫做loxp位点的dna序列。cre重组酶是噬菌体p1编码的38kd的蛋白，可以识别loxp上的两段13bp长的重组结合元件(recombinase binding elements,rbe)发挥剪切作用(mclellan et al.2017)。该技术具有高效性，特异性强，应用范围广等特点，在动植物基因工程操作中发挥重要作用，但是如何调控cre重组酶特异性的表达，从而更好的发挥效果是本领域技术人员需要解决的问题。

4、植物基因启动子是rna聚合酶识别、结合和开始转录的一段dna序列，它含有rna聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列。这些启动子通过调控下游基因的表达，决定了基因在时间和空间上有序的表达，这是植物的形态建成和维持正常生长周期的关键。植物组织特异型或条件诱导型启动子也是合理分配能量流向和环境适应性的主要因素。

5、目前基因工程技术中采用的启动子包括组成型启动子、诱导型启动子和组织特异型启动子。组成型启动子能够驱动目的基因在植物各组织中持续表达，但是会过度消耗受体细胞内的物质和能量，因此在应用中存在一定的缺陷。诱导型启动子在受外源物理、化学因素等的诱导下，能快速诱导基因转录的“开”与“关”，因此可根据实验需要调控转基因在植物中的表达。组织特异性启动子只在特定的器官或组织中才能启动下游基因的表达，从而克服了组成型启动子启动的外源基因在受体中非特异、持续、高效表达所造成的浪费，增加转基因的效果，因此在植物遗传改造过程中受到越来越多的重视，但是已经鉴定的好用的组织特异性启动子非常少。

6、因此，在动植物中寻找组织特异性启动子非常重要，通过组织特异性启动子驱动cre重组酶特异性的表达，在转基因过程中切除不再必要的基因或编辑元件是涉及生物安全和生命安全的重要研究内容。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供了一种在花药和雌蕊中特异表达的启动子，将其应用到转基因工程中。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明通过对烟草转录组数据进行分析，筛选出一个候选的花药和雌蕊特异表达启动子apsp，其核苷酸序列如seq id no.1所示。研究表明，相较于烟草转基因过程中的生长情况，该启动子在花药和雌蕊中启动下游基因的表达量是其他检测组织中的10倍以上。

4、本发明提供了seq id no.1所示的dna分子的获取方法，包括：首先提取烟草(n.tabacum栽培品种zy100)基因组dna，然后利用pcr技术克隆所述的dna分子片段；pcr扩增采用的引物为：f引物：5’-gagaaaaactagaaatttacgacataatttctcctaactttcactttgattttc-3’，r引物：5’-cagtaggatagaggtggctcccattaatcaacatacaatg-3’。

5、本发明提供了所述植物花药和雌蕊特异表达启动子apsp在构建于花药和雌蕊中特异性表达的基因表达盒或是于花药和雌蕊中特异性表达的基因表达载体中的应用。

6、通过在目的基因上游整合所述的启动子，该启动子在植物体生长期不能诱导或者较低水平诱导下游靶基因的表达，于花期的花药和雌蕊中特异性启动目的基因高表达。

7、进一步的，本发明提供了一种于花药和雌蕊中特异性表达的基因表达盒，包含所述的植物花药和雌蕊特异表达启动子。

8、进一步的，本发明提供了一种于花药和雌蕊中特异性表达的基因表达载体，包含所述的基因表达盒。

9、优选的，所述基因表达载体为无筛选标记转化载体。

10、优选的，所述无筛选标记转化载体为植物cre/loxp重组表达载体，所述植物cre/loxp重组表达载体的t-dna区内含有两个或两个以上同向loxp序列，两个同向1oxp序列之间含有cre重组酶表达盒和标记基因表达盒；所述cre重组酶表达盒的启动子为上述花药和雌蕊特异表达启动子。

11、所述的植物cre/loxp重组表达载体被转入植物后，在花药和雌蕊发育过程中，上述启动子驱动cre重组酶表达，将两个同向loxp序列之间的基因表达盒删除，从而去除标记基因和cre基因本身。

12、本发明研究表明，上述雌蕊和花药特异表达启动子apsp驱动cre重组酶表达可以切除多个靶位点，为植物基因工程中的多基因，多次系统改造提供技术支持。进一步的，在植物cre/loxp重组表达载体的t-dna区引入多个loxp序列，同向1oxp序列之间插入cre重组酶表达盒、标记基因表达盒或基因编辑元件表达盒。所述标记基因表达盒或基因编辑元件表达盒采用不同于cre重组酶表达盒的启动子，例如camv 35s启动子。

13、进一步的，本发明提供了一种重组工程菌，所述工程菌包含所述的基因表达载体。

14、本发明提供了一种在植物花药和雌蕊中表达目的核苷酸序列的方法，包括：构建含有所述启动子apsp和连接于所述启动子的目的核苷酸序列的表达载体，再向植物体导入所述表达载体，筛选培育获得转基因植株。

15、进一步的，所述的目的核苷酸序列可以是结构基因、调节基因或者能够干扰内源基因表达的小rna，其在花粉发育阶段特异性表达可以调节花粉的育性及花粉萌发。

16、所述植物为双子叶植物，进一步的，所述植物为烟草。

17、本发明还提供了一种培育无筛选标记的转基因植物的方法，包括：

18、(1)构建植物cre/loxp重组表达载体，所述植物cre/loxp重组表达载体的t-dna区内含有两个或两个以上loxp序列，两个同向1oxp序列之间含有cre重组酶表达盒和标记基因表达盒；cre重组酶表达盒中启动cre重组酶表达的启动子是上述的植物花药和雌蕊特异表达启动子apsp；

19、(2)利用转基因技术将植物cre/loxp重组表达载体的t-dna区导入受体植株，培育，获得无筛选标记的转基因植物。

20、上述方法中，所述启动子apsp驱动cre酶的表达，该启动子在转基因筛选阶段及分化阶段的愈伤组织，叶片，茎秆，根中不能诱导或者较低水平诱导下游靶基因cre的表达，在开花期的花药和雌蕊中诱导下游cre酶基因高表达，cre酶识别loxp上的重组结合元件发挥剪切作用。在不影响转基因t0代获得目标性状植物的前提下，在转基因t0代有性生殖过程中切除筛选标记基因。

21、进一步的，所述的植物cre/loxp重组表达载体还含有多克隆位点或外源目的基因的表达盒；多克隆位点或外源目的基因表达盒位于t-dna区内，在所述两个同向loxp序列区间之外。

22、本发明提供了一种无筛选标记及基因编辑元件的自发光转基因植物的培育方法，包括：

23、1)利用多基因组装技术将hpt基因、cas9基因、cre基因、hisps基因、cph基因、h3h基因和luz基因整合到受体载体中，构建获得多基因载体，所述多基因载体中含有两个或两个以上lox-p元件，所述hpt基因、cas9基因、cre基因表达模块在两个同向lox-p元件中间，cre基因的上游整合有启动子apsp；hisps基因、cph基因、h3h基因和luz基因表达模块在两个同向loxp序列区间之外；

24、2)利用转基因技术将多基因载体中的t-dna区片段导入受体植株中，培育，获得t0代转基因植株，在t1代幼苗期对转基因植株进行筛选，获得hpt和cas9剪切掉的转基因植株。

25、上述方法中，将构建的多基因片段导入受体植株中，使其在植株体内表达，表达的各蛋白酶参与咖啡酸循环，使植物发光，作为报告系统方便筛选转基因阳性植株。其中cre基因只在t0代转基因植株开花期，在生殖器官中表达，切除loxp位点中间的目标基因hpt和cas9。最终在t1代植株中获得筛选标记hpt基因及基因编辑中cas9基因切除的转基因植株。

26、其中hisps的序列信息见基因登录号：qjq48095.1；cph的序列信息见基因登录号：qjq48093.1；h3h的序列信息见基因登录号：qjq48094.1；luz的序列信息见基因登录号：qjq48096.1。hpt基因的序列信息见载体peasy-tub/hptii登录号mh752994.1中的hpt序列信息、cas9基因的序列信息见载体pylcrispr/cas9pubi-n登录号mg719602.1中的cas9序列信息、cre基因的序列信息见基因登录号：mk854762.1。

27、优选的，步骤1)中，采用transgene stacking ii系统进行多基因组装。以pyl322d1作为供体载体ⅰ，pyl322d2作为供体载体ⅱ，pyltac380gw作为受体载体，pylmf-h作为筛选标记hpt自删除供给载体，其中驱动cre重组酶表达的启动子替换成启动子apsp。

28、具体的，所述多基因载体的构建方法包括以下步骤：

29、a、将hisps、h3h基因片段分别插入pyl322d1的多克隆位点获得pyl322d1-35s-hisps，pyl322d1-35s-h3h；

30、cph、luz基因片段分别插入pyl322d2的多克隆位点获得pyl322d2-35s-cph，pyl322d2-35s-luz；

31、利用同源重组技术将pylmf-h基础载体中的pv4启动子替换成apsp启动子，在pylmf-h载体的xbaⅰ酶切位点添加p35s-cas9-t35s模块，构建得到pylmf-h-apsp-cre-35s-cas9-35s-hpt。

32、b、将供体载体pyl322d1-35s-hisps和受体载体pyltac380gw按1:1至2:1混合，共转入大肠杆菌ns3529感受态细胞中，涂布于含卡那霉素和氯霉素的双抗培养基中培养，取阳性菌株提取质粒；

33、c、使用归巢酶i-sce i对步骤b提取的质粒进行酶切，再转化大肠杆菌菌株neb10-β，培养，筛选，提取质粒，获得含有目的基因hisps的阳性克隆pyltac380gw-hisps；

34、d、将供体载体pyl322d2-35s-cph和步骤c制备的受体载体pyltac380gw-hisps按1:1至2:1混合，共转入大肠杆菌ns3529感受态细胞中，涂布于含卡那霉素和氨苄霉素的双抗培养基中培养，取阳性菌株提取质粒；

35、e、使用归巢酶pi-sce i对步骤d提取的质粒进行酶切，再转化大肠杆菌菌株neb10-β，培养，筛选，提取质粒，获得含目的基因hisps和cph的阳性克隆pyltac380gw-hisps-cph；

36、f、重复步骤b-e，以上一步骤获得的含有目的基因的新质粒作为受体载体，交叉使用含不同基因的d1、d2供体载体进行重组，至hisps、cph、h3h、luz基因组装到受体载体上，最后一步与pylmf-h-apsp-cre-35s-cas9-35s-hpt进行bp重组反应连入可去除筛选标记基因hpt和cas9基因表达盒元件，构建得到多基因载体。

37、本发明具备的有益效果：

38、(1)本发明首次从烟草基因组中鉴定出如seq id no.1所示的启动子序列，为花药和雌蕊特异表达启动子。该启动子对植物基因工程研究和应用具有重要作用，其应用前景十分广阔。

39、(2)本发明利用该启动子构建无筛选标记和基因编辑元件的生物自发光系统模块，使用fbp生物发光系统对转基因植株进行高效鉴定，并在转基因t0代有性生殖过程中切除筛选标记基因和基因编辑cas9元件，获得生物安全性更好的转基因植株。此外，切除了筛选标记基因后的植株还可以继续在下一轮用携带筛选标记的载体转化，达到多轮转入大量目的基因的目的，做到对作物基因组做多轮的改造。