本发明属于抗体检测的，具体涉及一种新型冠状病毒抗体检测试剂盒。
背景技术：
1、冠状病毒(coronaviridae)属于冠状病毒科冠状病毒属。冠状病毒属的病毒 是具外套膜的正链单股rna病毒，直径约80-120nm，其遗传物质是所有rna 病毒中最大的，感染宿主范围宽，可感染人、鼠、猪、猫、犬、禽类脊椎动物。冠状病毒属于rna病毒。
2、2019年新型冠状病毒感染最常见的症状为发烧、咳嗽、肌痛或疲劳。由于新型冠状病毒会对人们的身体造成极大的伤害，疫情防控已经成为各国政府和人民的共同任务。疾控专家提出了“早发现、早隔离、早治疗”的防控措施，诊断试剂盒成为疫情防控不可或缺的工具。
3、目前已开发出的诊断试剂盒按检测目标可以分为两类，一类是检测病毒的核酸，一类是检测病毒的抗体。
4、当前阶段诊断试剂盒的重要应用场景包括：入境人员排查、密切接触者排查、高危环境工作人员排查、重点地区人员排查、解除隔离人员排查、复工人员排查等，上述应用场景的一个共同特点是大量的待排查人员未表现出明显症状(包括无症状、非典型症状、轻微症状)。
5、因此，开发一种对于无明显症状人群的新冠病毒抗体检测具有高灵敏度和高特异性的诊断试剂盒，乃当务之急，更具长远意义。
技术实现思路
1、针对现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供一种新型冠状病毒抗体检测试剂盒。
2、为了实现上述技术目的，本发明采用的技术方案为：
3、一种新型冠状病毒抗原表位肽，包括下述多肽的一种或几种：
4、seq id no:1：s33，rqiapgqtgkiadyny；
5、seq id no:2：s82，kpskrsfiedllfnkvtlad；
6、seq id no:3(s176-190)，lmdlegkqgnfknlr；
7、seq id no:4 (n43-57)，qglpnntaswftalt。
8、进一步地，在本发明的具体实施方式中，所述抗原表位肽为seq id no:1~4。
9、术语“新型冠状病毒”(novel coronavirus pneumonia,ncp)简称新冠，指由2019新型冠状病毒(简称新冠病毒，2019 novel coronavirus，2019-ncov) 感染导致的病症。
10、抗原表位：又称抗原决定簇(antigenic determinant)，是抗原物质分子表面或其他部位具有一定组成和结构的特殊化学基团，能够与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异结合的结构。在免疫应答过程中，t细胞的抗原受体tcr和b细胞的抗原受体bcr所识别的表位具有不同特点，分别被称为t细胞表位和b细胞表位。t细胞表位一般不位于抗原分子表面，须由抗原呈递细胞将抗原加工处理为小分子多肽并与mhc分子结合，才能被tcr识别。t细胞仅能识别经加工处理的表位。而b细胞表位可存在于抗原分子表面，不须经加工处理，即可直接被b细胞所识别。本技术中指预测的或者筛选的能够与抗体特异性结合的一条或多条肽段。
11、多肽：本技术中指预测的或者筛选的能够与抗体或致敏淋巴细胞特异性结合的任意一条肽段。
12、本发明提供一种多肽-载体蛋白偶联物，所述多肽-载体蛋白偶联物包括前述的多肽以及与多肽偶联的载体蛋白。
13、多肽-载体蛋白偶联物：本技术中指一条多肽与载体蛋白偶联形成的抗原，其中，一个载体蛋白可以偶联一条或多条多肽，多条多肽偶联时，多条多肽具有相同或不同的氨基酸序列。根据具体偶联的多肽序列的理化性质的差异、具体载体蛋白的种类的不同以及偶联方法的不同，每个载体蛋白上所偶联的多肽的条数有所差异，本技术中优选1～4条，可以理解为，可以选取范围值的两端数值或中间任意数值。
14、进一步地，所述载体蛋白选自牛血清蛋白、卵清白蛋白、钥孔血蓝蛋白或酪蛋白。
15、进一步地，所述多肽通过连接序列与载体蛋白偶联。
16、本发明提供一种抗原，其特征在于，所述抗原包括前述的多肽-载体蛋白偶联物。
17、本发明提供一种前述抗原表位肽在病毒免疫检测中的应用。
18、进一步地，以获得的抗原表位作为参考化学合成抗原，以合成抗原制备试剂盒抗原包被板，按常规方法制备检测产品，使用检测产品检测血清中新型冠状病毒抗体。
19、本发明提供一种新型冠状病毒检测试剂盒，其特征在于，其包括前述的新型冠状病毒抗原表位肽。
20、进一步地，其用于无明显症状的2019新型冠状病毒sars-cov-2疑似患者的诊断。
21、术语“sars-cov-2”感染患者通常表现为发热、干咳和呼吸困难等和腹泻等胃肠道症状，其次为严重急性呼吸道感染，部分病例会出现急性呼吸窘迫症合并严重呼吸道并发症。目前感染患者没有特定的治疗方法，早期诊断并及时管控是阻止疫情进一步播散和控制新感染线索的关键。
22、本发明具有如下有益效果：
23、本发明试剂盒可以用于检测2019-ncov新冠病毒患者（特别是无明显症状的新型冠状病毒sars-cov-2疑似患者）的检测，特异性为100%，精密度、稳定性好，可用于新冠状病毒抗体的用途。
24、实施方式
25、下面对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
26、实施例中未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照制造商所建议的条件。若未特别指明，实施例中所用原料均为市售商品。
27、除非另外定义或由背景清楚指示，否则在本公开中的全部技术与科学术语具有如本 公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
28、完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂为sigma公司产品。其他试剂为国产或进口分析纯试剂。
29、实施例
30、1、多肽制备
31、将编码优势抗原表位的基因按照一定的排列组合串联，具体顺序为s33、s82、s176-190、n43-57，构建了4个融合抗原基因，经过稀有密码子在线软件对融合基因中的大肠杆菌稀有密码子进行分析，并用编码相同氨基酸的大肠杆菌偏爱密码子核苷酸替换大肠杆菌的稀有密码子，使最终合成的多表位融合基因中不含有大肠杆菌的稀有密码子。最后进行新型冠状病毒特异性融合蛋白抗原核苷酸序列合成。
32、所述多肽的氨基酸序列(氨基酸的单字母符号)如下：
33、seq id no:1：s33，rqiapgqtgkiadyny；
34、seq id no:2：s82，kpskrsfiedllfnkvtlad；
35、seq id no:3(s176-190)，lmdlegkqgnfknlr；
36、seq id no:4 (n43-57)，qglpnntaswftalt。
37、2、新型冠状病毒抗原纯度鉴定
38、用蛋白质sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测纯化后蛋白的纯度：配制12%分离胶，小心注入玻璃板间隙内，至高度为11cm，上面加入纯水，隔离空气，室温聚合30~60min，倾去纯水，吸水纸吸干残留液体，配制浓缩胶，注入分离胶上端，高度为1cm，小心插入梳子，避免气泡产生，室温聚合30~45 min。20μl样品加入等体积2x上样缓冲液混匀，100 ℃加热5 min。每孔上样20μl，首先以80v进行，待样品进入分离胶后调整为120 v，直至溴酚蓝抵达分离胶底部。考马斯亮蓝染色：将凝胶浸泡于考马斯亮蓝染液中，振荡染色4 h，脱色液脱色至蛋白条带清晰吋，分析蛋白的条带，分离蛋白条带清晰，没有杂带，达到纯化要求。
39、3、免疫原的制备
40、多肽片段与牛血清蛋白连接：取纯化后的多肽5mg与牛血清蛋白10 mg在缩合剂的催化下进行缩合反应，得到多肽-牛血清蛋白偶联物。
41、多肽-牛血清蛋白偶联实验步骤如下：
42、（1）取20mg 牛血清蛋白用pbs(ph 7)溶解，使终浓度为10mg/ml，加入偶联试剂mbs（thermo fisher)，在室温条件下反应1h，形成牛血清蛋白-mbs复合物，用pbs透析除去游离偶联试剂。
43、（2）取10mg多肽(对于不含半胱氨酸的多肽片段，在其序列氨基端或羧基端引入半胱氨酸)，用pbs溶解，得到浓度为10mg/ml的溶液。
44、（3）将多肽溶液与准备好的牛血清蛋白-mbs混合，室温反应2h。
45、（4）将反应混合液用pbs透析，终止反应，得抗原牛血清蛋白-多肽。
46、（5）蛋白定量，所得抗原浓度约为5mg/ml，其中多肽约为0.5mg/ml。
47、4.动物免疫
48、动物：经过检疫无病原菌的健康新西兰兔，体重1.2~1.6kg，皮毛有光泽，饮食正常，对其进 行免疫，每个抗原免疫3只。用弗氏完全佐剂与前面制备的抗原牛血清蛋白-多肽等体积混合乳化后，于每只兔两后腿足部皮下，淋巴结处及背部皮下多点接种，接种总量为2ml；间隔14日后用弗氏不完全佐剂与等量抗原混合乳化后，仍以上述剂量由背部皮下多点接种，进行第二次免疫；于二免后14日采血，进行elisa测定，抗体滴度约1:10000-1:1000000，随即采取全血。同时另设1组（3只新西兰兔）为未偶联多肽抗原的单独牛血清蛋白组和1组（3只新西兰兔）为单纯佐剂组。牛血清蛋白单独对照组使用与多肽-牛血清蛋白组中等量的牛血清蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合进行注射，单纯佐剂组中则仅使用与多肽实验组终溶液 等体积的弗氏完全佐剂原浓度溶液进行注射。牛血清蛋白单独对照组及单纯佐剂组使用与多肽实验组同等给药方式及给药频次进行实验。
49、5.多肽结合抗体测定
50、用有机化学固相合成的多肽片段(未偶联牛血清蛋白的)包被酶联反应板测定抗体结合效价，具体如下：
51、(1)包被：取多肽溶液(2mg/ml)100μl，加入0.05m碳酸盐缓冲液100ml中， 混匀，得包被溶液，浓度为2μg/ml。并设置空白对照和阴性对照。
52、(2)酶联反应板每孔加入多肽溶液100μl,置4℃过夜，而后弃去孔中液体。(为避免蒸发，板上应加盖或将板平放在底部有湿纱布的金属湿盒中)。
53、(3)封闭酶标反应孔：将封闭液(5％小牛血清)加满各反应孔，并去除各孔中的 气泡,37℃封闭40min。
54、(4)洗涤：吸干孔内反应液，用洗涤液注满板孔，放置3min略作摇动，吸干孔内 液，倾去液体后在吸水纸上拍干。洗涤3次。
55、(5)加样：在梯度稀释板，加入待检测样品，建立合适的浓度梯度，如1:500, 1:2000,1:8000,1:32000，1:128000，1:512000，1:2048000。将稀释好的样品加入酶标反 应孔中，每样品加3孔，每孔100μl，置于37℃，60min，然后用洗涤液满孔洗涤3 次，每次3min。
56、(6)加入酶标抗体：采用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔igg(zsgb-bio)作为二 抗，按1:20000用pbs(ph7.4)稀释，每孔加入100μl，37℃反应60min，然后用洗涤 液满孔洗涤3次，每次3min。
57、(7)显色：采用四甲基联苯胺(tmb)作为显色剂，每孔加入tmb-过氧化氢尿 素溶液100μl，置37℃避光放置3-5分钟，然后每孔加入终止液(2mol/l硫酸溶液)50μl 终止反应。
58、(8)检测：显色反应终止20min内，于450nm处测定光密度值。
59、结果见表1。可见，4个多肽抗原免疫新西兰兔后，血清中均产生了针对多肽片段的抗体，抗体结合效价较高，单独牛血清蛋白组和单纯佐剂组均未检测到效价。
60、表1 多肽序列免疫效价
61、 序列信息 多肽结合效价 rqiapgqtgkiadyny 2105000 kpskrsfiedllfnkvtlad 2203000 lmdlegkqgnfknlr 2271000 qglpnntaswftalt 2233000
62、采用常规方法在ipdms膜固相载体上分别点样上述seq id no：1~4所示的多肽抗原的溶液，另点样阳性质控点和阴性质控点，制备试剂盒 (48孔板形式的芯片反应板)，用试剂盒进行检测。检测步骤如下：
63、1. 准备工作：试验前试剂和测试样品需平衡至室温；血清用血清稀释液稀释100倍（全血稀释50倍）。
64、2. 润湿芯片：取出芯片反应板。用清洗液浸润芯片表面3分钟，后弃去洗液。
65、3. 加入样品：取 100μl待测样品加入芯片反应孔中。
66、4. 样品孵育：将芯片反应板放入恒温孵育器中，37℃，500rpm孵育30分钟。
67、5. 样品清洗：将芯片反应孔中的样品弃去，用洗液淋洗反应孔并甩掉，重复3次。
68、6. 加入酶抗：往芯片反应孔中加入100μl酶标抗体液，所述酶标抗体为hrp标记的山羊抗人igg抗体。
69、7. 酶抗孵育：将芯片反应板放入恒温孵育器中，以37℃，500rpm孵育30分钟。
70、8. 酶抗清洗：将芯片反应孔中的酶标抗体液弃去，使用清洗液冲洗反应孔并甩掉，重复3次。
71、9. 显色：每孔加入70μl显色底物液，室温静止反应5-10min。
72、10. 弃掉显色液，撬盖（用一字螺丝刀），用超纯水淋洗3次，晾干/吹干。
73、11. 用48孔微阵列芯片成像仪拍照，自动采集显色信号。
74、特异性结果判定：
75、对于试剂盒，当所述多肽中的至少两个对来自对象的样本有响应(dmi>1)时，判定为该对象被新型冠状病毒sars-cov-2感染(阳性)；否则，判定为该对象未被新型冠状病毒sars-cov-2感染(阴性)。
76、“响应”是指用上述识读设备读取的信号值大于或等于10。阳性质控点的信号值远大于10，阴性质控点的信号值远小于10。
77、采用上述试剂盒对40例健康小鼠血清样本进行测定，结果均为阴性40例、阳性0例。因此，特异性为40/40、即100%。
78、采用上述试剂盒对30例临床诊断为2019-ncov 、但无明显症状的小鼠血清样本进行测定，结果均为阳性30例、阴性0例。因此，特异性为30/30、即100%。
79、稳定性：2019-ncov检测试剂盒在37℃分别放置7天，测定高、中、低3种浓度质控的信号保留率。结果均＞98％，表明试剂盒稳定好，符合临床要求。
80、精密度：分别对高、中、低值质控品进行测定，每天两次，分上下午检测，每次进行4个重复，共检测10天，每种浓度共测定 80次，计算变异系数，检查试剂在高值、中值和低值标本时的测定精密度。结果表明变异系数都在5％以内，重复性好。
81、尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。