一种体液中提取外泌体的钠基蒙脱石（Na-MMT）吸附柱法的制作方法

一种体液中提取外泌体的钠基蒙脱石(na-mmt)吸附柱法
技术领域
1.本发明是一种吸附柱法，特别涉及一种体液中提取外泌体的钠基蒙脱石(na-mmt)吸附柱法。


背景技术：

2.1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987年johnstone将其命名为"exosome"。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。
3.外泌体是指包含了复杂rna和蛋白质的小膜泡(30-150nm)。
4.目前，外泌体提取方法包括超速离心法、超滤法、磁珠免疫法、沉淀试剂法、密度梯度离心法和分子排阻法等多种方法都是根据外泌体特性而进行分离提取。
5.外泌体是细胞分泌的具有磷脂双分子层的纳米囊泡，其膜性质与细胞膜类似。外泌体主要包含以下脂质：(1)脂筏相关脂质(如胆固醇)；(2)鞘脂(如鞘磷脂和神经酰胺)；(3)磷脂；(4)甘油磷脂类(如磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸)。
6.外泌体具有磷脂双分子层，磷脂含量60％-70％。文献“钠基蒙脱石对菜籽油中磷脂的吸附行为研究”中报导钠基蒙脱石对菜籽油中磷脂的有吸附作用，分析磷脂在钠基蒙脱石的吸附等温线发现，当温度从20℃升至30℃时，钠基蒙脱石对磷脂的吸附量是增加的，但是温度从40℃升至60℃之间，磷脂的吸附量减少。根据此吸附原理，我们大胆创新将钠基蒙脱石制成吸附柱，通过温度控制其吸附能力，最终达到分离提取外泌体的效果。


技术实现要素：

7.本发明主要是解决现有技术中存在的不足，提供一种体液中提取外泌体的钠基蒙脱石(na-mmt)吸附柱的新方法，该方法简单新颖易操作，成本低，且提取的外泌体纯度高，电镜下检测杂质少，背景极低；采用一种对磷脂有吸附作用的材质钠基蒙脱石(na-mmt)制备成吸附柱，通过温度控制该吸附柱对外泌体的吸附能力，达到分离外泌体的效果。
8.本发明的上述技术问题主要是通过下述技术方案得以解决的：
9.一种体液中提取外泌体的钠基蒙脱石(na-mmt)吸附柱法，按以下步骤进行：
10.①
提取样本体液，样本体液包括尿液﹑血浆﹑血清，脑脊液，经过低速离心预处理；
11.②
先后用0.8um和0.22um针头式过滤器对预处理后的上清液进行过滤；
12.③
取适量过滤后样本，na—mmt柱和pbs于20℃-40℃的温度中，水浴30分钟，使得与水浴锅设置温度一致；适量pbs于40-60℃水浴30min以上使得与水浴锅设置温度一致，实验需要时拿出来使用；
13.④
水浴锅中快速取出na—mmt柱，取出水浴锅中的提取样本，上样，待下端无液体流出；
14.⑤
在温度为20℃-40℃加入适量的pbs进行清洗，待下端无液体流出；
15.⑥
在温度为40-60℃中加入pbs进行洗脱，接取外泌体0.5-5ml，在温度为-80℃下进行冷冻保存。
16.作为优选，步骤
④
中，上样过程中为保证柱体和样品的温度在20℃-40℃，需尽快操作避免滞留；步骤
⑥
中，如需提高外泌体浓度，可使用100kd超滤管4℃，3000r离心15min后再使用少量pbs洗脱超滤膜，回收外泌体；或直接接取外泌体浓度较高的体积0.5-2ml。
17.作为优选，na-mmt柱为磷脂有吸附力的固体颗粒。
18.作为优选，na-mmt柱包括蒙脱石，钠基蒙脱石，钙基蒙脱石其中的一种或多种。
19.作为优选，na-mmt柱包括针筒空管、筛板、尼龙网格滤膜、钠基蒙脱石颗粒、上盖和底盖，所述的针筒空管的上端与底端分别设有筛板，所述的底盖设在底端筛板的底部，上端筛板的下方设有尼龙网格滤膜，所述的尼龙网格滤膜与底端筛板间设有均匀分布的钠基蒙脱石颗粒，所述的针筒空管的上部设有上盖。
20.作为优选，钠基蒙脱石颗粒的直径为2-4mm。
21.作为优选，样本过柱温度为20-40℃。
22.作为优选，样品过柱后，pbs清洗温度为20-40℃；pbs清洗体积0-1ml，取决于样本类型和杂质量；尿液样本为0-0.5ml清洗体积，血浆样本为0.5-1ml清洗体积。
23.作为优选，尿液样本为晨尿。
24.该方法简单新颖易操作，成本低，且提取的外泌体纯度高，电镜下检测杂质少，背景极低。
附图说明
25.图1为本发明中钠基蒙脱石柱的结构示意图；
26.图2为本发明中western blot方法验证钠基蒙脱石吸附柱法得到的尿液外泌体，hsp70，tsg101，cd9和cd63为人类的外泌体标志性蛋白；
27.图3为本发明中电镜验证钠基蒙脱石吸附柱法得到的尿液外泌体；
28.图4为本发明中nta验证钠基蒙脱石吸附柱法得到的尿液外泌体；zetaview纳米颗粒跟踪分析仪进行nta检测，上机检测浓度为6.9
×
108particles/ml。
具体实施方式
29.下面通过实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。
30.实施例1：尿液样本外泌体的提取：
31.1. 4℃，1000r离心10min，转移尿液上清液于新的50ml离心管，弃沉淀。
32.2.尿液样本4℃，3000r离心10min，弃沉淀。
33.3.-80℃冷冻半小时，融化后3000r离心10min，弃沉淀。
34.4.用一次性使用注射器取10ml尿液上清液，先后使用0.8um和0.22um针头式过滤器对上清液进行过滤。
35.5.取适量15ml尿液，na-mmt柱和pbs于35℃水浴30分钟，使得与水浴锅设置温度一致。适量pbs于60℃水浴30min以上使得与水浴锅设置温度一致，实验需要时拿出来使用。
36.6.水浴锅中取出钠基蒙脱石柱，快速加入尿液，待下端无液体流出。
37.7. 35℃1mlpbs清洗，待下端无液体流出。
38.8. 60℃pbs洗脱，接样5ml。
39.9. 100kd超滤管加入接到的5ml样品，4℃，3000r离心15min。
40.10.加1mlpbs于超滤膜上。用移液枪吸取滤膜上的pbs，反复轻轻吹洗超滤膜后，收集滤膜上的溶液即为外泌体，于﹣80℃冷冻保存。
41.实施例2：尿液样本外泌体的提取：
42.1. 4℃，1000r离心10min，转移尿液上清液于新的50ml离心管，弃沉淀。
43.2.尿液样本4℃，3000r离心10min，弃沉淀。
44.3.-80℃冷冻半小时，融化后3000r离心10min，弃沉淀。
45.4.用一次性使用注射器取10ml尿液上清液，先后使用0.8um和0.22um针头式过滤器对上清液进行过滤。
46.5.取适量15ml尿液和na-mmt柱于35℃水浴30分钟，使得与水浴锅设置温度一致。适量pbs于60℃水浴30min以上使得与水浴锅设置温度一致，实验需要时拿出来使用。
47.6.水浴锅中取出钠基蒙脱石柱，快速加入尿液，待下端无液体流出。
48.7. 60℃pbs洗脱，接样2ml，﹣80℃冷冻保存。
49.实施例3：血浆样本外泌体的提取：
50.1.血浆样本加等体积的pbs稀释一倍。
51.2.使用0.8um和0.22um针头式过滤器对血浆样本进行过滤。
52.3.过滤后的血浆样本，4℃，10000r离心10min，弃沉淀。
53.4. 1ml离心后的血浆样本，na-mmt柱和pbs于35℃水浴30分钟，使得与水浴锅设置温度一致。适量pbs于60℃水浴30min以上使得与水浴锅设置温度一致，实验需要时拿出来使用。
54.5.水浴锅中取出钠基蒙脱石柱，快速加入血浆样本，待下端无液体流出。
55.6. 35℃1mlpbs清洗，待下端无液体流出。
56.7. 60℃pbs洗脱，接样收集外泌体2ml，﹣80℃冷冻保存。