本发明涉及生物,具体而言,涉及pkd1和pkd2基因的引物组合物、试剂盒及测序方法。
背景技术:
1、多囊肾是累及双侧肾脏的遗传性疾病,肾脏上充满液体的囊群,称为囊肿,肾囊肿的体积大小和数量随着个体年龄增加而缓慢地增加,严重干扰了肾脏过滤血液中废物的能力。囊肿的生长会导致肾脏不断变大,甚至导致肾衰竭,是人体中最常见的先天性遗传囊性肾病。常染色体显性遗传多囊肾(adpkd)病发病率约为1/500~1/1000人。统计数据显示,我国约有150-300万先天性多囊肾病人。
2、adpkd患者约85%是由pkd1基因突变所导致的,约15%是由pkd2基因突变所导致的;已知的pkd1基因突变没有明显热点突变,广泛分布,pkd1基因组区域复杂,1-33号外显子区域有6个假基因(pkd1p1-p6),同源性高达97.7%,且个别区域gc含量极高,给常规基因检测带来了很大的困难。
3、以往围绕多囊肾基因突变检测有lr-pcr一代测序、长读长pcr(long read-pcr,简称lr-pcr)结合ngs测序、全外显子测序(whole exome sequencing,简称wes测序)等多种检测方法,然而现有方法均有缺陷,检测灵敏度、特异性都有待提高。一代测序操作费时费力,且个别区段区分不了pkd1真假基因;捕获测序虽然变异类型覆盖全,但是面临着探针合成昂贵、实验操作步骤繁琐、实验周期长以及在gc含量极高的区域捕获效果差的问题,因此在多囊肾基因突变临床检测上并未得到大规模推广应用。
4、lr-pcr结合ngs测序借助lr-pcr开展长片段pcr扩增,虽然可以区分真假基因,但是lr-pcr都是在目的区段的上下游设计一对正、反向扩增引物,当扩增区域发生sv结构变异之后,往往导致无法扩增。比如当扩增区域内发生倒位后,将导致正、反向引物变成同方向引物,无法扩增;或者当扩增区域内发生异位后,将导致正、反向引物相距太远,也无法扩增;或者当扩增区域发生大的缺失变异,导致正、反向引物结合位点缺失之后,也将导致无法扩增。因此,lr-pcr检测方法不能覆盖全部变异类型。
5、临床上迫切需要克服现有的检测技术缺陷,提升多囊肾基因突变检测灵敏度、特异性的方法。
技术实现思路
1、有鉴于此,本发明的目的是提供pkd1和pkd2基因的引物组合物、试剂盒及测序方法,该引物组合物、试剂盒及测序方法能够覆盖全部变异类型,快捷方便且经济实用,实现了对多囊肾基因pkd1和pkd2基因的快速检测。
2、基于上述目的,本发明的第一个方面提供了一种引物组合物,其中,
3、1)所述引物组合物用于检测pkd1和pkd2基因,且检测的pkd1和pkd2基因长度不低于2kb;
4、2)包含多个引物,所述多个引物均匀覆盖pkd1和pkd2基因,且每两个相邻引物在与所述pkd1和pkd2基因结合时,覆盖位点平均具有不多于10bp的重叠区域,或者平均间隔为1bp~4kb;优选地,每两个相邻引物所覆盖位点的平均间隔为1kb~3kb;更优选地,每两个相邻引物所覆盖位点的平均间隔为1900~2100bp;
5、3)所述引物组合物覆盖pkd1和pkd2基因全长;
6、4)所述引物组合物中的引物的核酸序列与pkd1和pkd2基因互补配对;
7、优选地,所述pkd1和pkd2基因的种属来源于动物;
8、更优选地,所述pkd1和pkd2基因的种属来源于灵长类动物;
9、进一步优选地,所述pkd1和pkd2基因的种属来源于人。
10、在本发明的优选的实施方案中,其中,所述引物组合物包括pool a引物组和poolb引物组;其中所述pool a引物组具有seq id no:1-seq id no:61的序列,所述pool b引物组具有seq id no:62-seq id no:122的序列。
11、本发明的第二个方面提供了一种pkd1和pkd2基因的测序方法,其包括以下步骤:
12、i)将待测样品中的基因组dna打断为多个核酸片段;
13、ii)使用上述引物组合物对所述核酸片段中的pkd1和pkd2基因进行扩增;
14、iii)对所述pkd1和pkd2基因进行测序;
15、所述测序方法用于非疾病诊断或治疗目的。
16、在本发明的优选的实施方案中,所述步骤i)还包括将所述核酸片段进行末端修复后连接接头序列;
17、优选地,所述核酸片段的长度为2~10kb;
18、更优选地,所述核酸片段的长度为4~6kb。
19、在本发明的优选的实施方案中,所述扩增包括以下步骤:
20、a)以步骤i)得到的核酸片段为模板,使用pool a引物组进行扩增,得到第一扩增产物;
21、b)以第一扩增产物为模板,使用通用引物primer la+primer r进行扩增,得到第二扩增产物;
22、c)以第二扩增产物为模板,使用pool b引物组进行扩增,得到第三扩增产物;
23、d)以第三扩增产物为模板,使用通用引物primer lb+primer r进行扩增,得到扩增终产物;
24、其中,所述primer la的序列如seq id no:123所示,所述primer r的序列如seqid no:124所示,所述primer lb的序列如seq id no:125所示。
25、在本发明的优选的实施方案中,所述扩增还包括对第一扩增产物、第二扩增产物、第三扩增产物和扩增终产物进行纯化。
26、在本发明的优选的实施方案中,所述测序为三代测序;
27、优选地,所述三代测序采用pacbio sequel、promethion、minion、gridion平台进行。
28、本发明的第三个方面提供了一种用于pkd1和pkd2基因测序的试剂盒,其包括上述引物组合物;
29、优选地,所述试剂盒还包括接头序列、通用引物、dna提取体系、pcr反应缓冲液、无核酸酶的水、dna聚合酶、分子量marker、末端修复酶、末端修复缓冲液、dna连接酶中的一种或多种;
30、优选地,所述通用引物为primer la、primer r和primer lb,所述primer la的序列如seq id no:123所示,所述primer r的序列如seq id no:124所示,所述primer lb的序列如seq id no:125所示。
31、本发明的第四个方面提供了上述引物组合物或上述试剂盒在检测pkd1和pkd2基因变异中的应用;
32、优选地,所述pkd1和pkd2基因变异包括插入、缺失、复制、倒位、易位或snp。
33、本发明的第五个方面提供了上述引物组合物或上述试剂盒在制备常染色体显性多囊肾疾病诊断试剂中的应用。
34、本发明的有益效果为:
35、(1)成功检测出常规方法难以检测的结构变异,提升了常染色体显性多囊肾检测的灵敏度,为发现新的致病突变提供分子生物学依据。
36、(2)本发明实验操作简单,实验周期短、成本临床可及,具有显著的临床推广应用价值。