一种衰老SH-SY5Y细胞氧糖剥夺再灌注模型及其构建方法和应用与流程

一种衰老sh-sy5y细胞氧糖剥夺再灌注模型及其构建方法和应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种衰老sh-sy5y细胞氧糖剥夺再灌注模型及其构建方法和应用。


背景技术：

2.氧糖剥夺/再复氧(oxygen glucose deprivation/reoxygenation，ogd/r)损伤的人神经母瘤细胞(sh-sy5y)模型可以模拟体内的脑缺血再灌注期间损伤病理过程，己成为离体水平研究脑缺血损伤机制及药物作用的重要手段。通过控制ogd暴露的持续时间，可以观察不同时间节点的病理状况；运用各种分子生物学技术，可以靶向地分析某一功能分子与药物作用的关系。
3.现有研究表明脑缺血再灌注损伤具有增龄性差异，那么，在细胞水平上研究药物的神经保护作用就不宜用一般的sh-sy5y细胞ogd/r模型。因此亟需建立一个衰老sh-sy5y细胞氧糖剥夺再灌注模型，以模拟老龄脑缺血缺氧损伤过程的病理生理过程。
4.d-半乳糖(d-galactose，d-gal)一种细胞衰老诱导剂。正常浓度的d-gal在体内肝脏转化为葡萄糖，而较高浓度的d-gal，可经半乳糖氧化酶催化，产生过氧化氢和醛糖，由此大量的ros进而引起蛋白质和脂质过氧化，也可造成线粒体损伤和功能紊乱，引起能量代谢障碍，最终导致细胞衰老。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种衰老sh-sy5y细胞氧糖剥夺再灌注模型及其构建方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明成功构建了一个衰老细胞ogd/r模型，该模型可以模拟老龄脑缺血缺氧损伤过程的病理生理过程，为后续研究药物的神经保护作用奠定了基础。
6.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
7.本发明提供一种衰老sh-sy5y细胞氧糖剥夺再灌注模型的构建方法，包括以下步骤：
8.(1)利用d-半乳糖使sh-sy5y细胞致衰老，构建得到衰老sh-sy5y细胞；
9.(2)所述衰老sh-sy5y细胞先经过缺糖缺氧处理，再经复氧处理，得到所述衰老sh-sy5y细胞氧糖剥夺再灌注模型。
10.进一步地，在步骤(1)中，所述d-半乳糖的使用浓度为100mm。
11.进一步地，所述d-半乳糖的致衰老时间为48h。
12.进一步地，在步骤(2)中，所述缺糖缺氧处理具体为：将步骤(1)得到的衰老sh-sy5y细胞置于无糖dmem培养液中，通入99.9％高纯度氮气后密封培养。
13.进一步地，通入99.9％高纯度氮气时，流速为1l/min，通入时间为5min。
14.进一步地，所述密封培养的时间为1h。
15.进一步地，在步骤(2)中，所述复氧处理的时间为24h。
16.本发明还提供一种根据上述的构建方法构建得到的衰老sh-sy5y细胞氧糖剥夺再灌注模型。
17.本发明还提供上述的衰老sh-sy5y细胞氧糖剥夺再灌注模型在筛选神经保护药物中的应用。
18.本发明公开了以下技术效果：
19.本发明首先用cck8法确定d-gal作用sh-sy5y细胞诱导衰老的浓度和时间，用细胞活力、细胞周期、细胞增殖检测以及sa-β-gal染色法验证细胞衰老，在此基础上用d-gal致衰老sh-sy5y细胞建立ogd/r模型，以cck8法确定衰老细胞ogd和复氧时间，最终确定衰老sh-sy5y细胞ogd/r模型构建中采用100mm d-gal致衰老48h后ogd 1h和复氧24h模式。本发明成功构建了sh-sy5y细胞氧糖剥夺再灌注模型，该模型可以模拟老龄脑缺血缺氧损伤过程的病理生理过程，为后续研究药物的神经保护作用奠定了基础。
附图说明
20.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
21.图1为显微镜下观察不同浓度d-gal作用sh-sy5y细胞48h后形态变化(100
×
)；其中，a：control组，b：25mm组，c：50mm组，d：100mm组，e：200mm组，f：400mm组，图中黑色箭头所示为神经细胞间隙增宽，细胞形态改变；a-f中标尺均为100μm；
22.图2为不同d-gal浓度梯度下处理sh-sy5y细胞48h后细胞活性情况；****表示p《0.001；
23.图3为不同d-gal浓度梯度下β-半乳糖苷酶染色(
×
400)；其中，a-f分别为control组、25mm组、50mm组、100mm组、200mm组和400mm组的β-半乳糖苷酶染色图，g为数据统计染色细胞的阳性率；*p《0.05；**p《0.01；
24.图4为不同d-gal浓度梯度下edu染色图(
×
400)；其中，a表示细胞增殖图，b表示数据统计增殖细胞比率；*p《0.05；**p《0.01；a中标尺均为100μm；
25.图5为流式细胞仪检测不同d-gal浓度梯度下的细胞周期；
26.图6为不同缺糖缺氧时间细胞存活率的比较，***p《0.005，****p《0.001。
具体实施方式
27.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
28.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
29.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
30.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
31.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
32.实施例1
33.1材料与方法
34.1.1实验主要试剂
35.表1主要实验试剂
[0036][0037][0038]
1.2主要仪器设备
[0039]
表2主要仪器设备
[0040][0041][0042]
1.3试剂的配置
[0043]
(1)d-gal母液的配置：精密称取d-gal粉末，灭菌超纯水溶解，配置成终浓度为1mol/l的母液，现配现用，按照试验需求再进行浓度稀释。
[0044]
(2)完全培养基的配置：在基础培养基(dmem/f12)中加入1％(v/v)的双抗(青霉素/链霉素溶液)和10％(v/v)的胎牛血清。
[0045]
1.4实验方法
[0046]
1.4.1sh-sy5y细胞的培养
[0047]
(1)sh-sy5y细胞培养均使用含10％fbs的dmem细胞培养基，置于37℃，含95％o2、5％co2的培养箱内培养。
[0048]
(2)细胞复苏：实验前，超净层流细胞操作台及离心管紫外照射消毒30min，湿酒精棉球擦拭操作台台面2遍。预先开启恒温水浴锅，温度设置为40℃，从-80℃超低温冰箱迅速取出细胞冻存管，快速放入水浴锅解冻，并来回轻轻晃动。待液体溶解后，迅速转移至提前加了2ml完全培养基的ep管中，1000rpm，离心5min，吸弃上清液加入1ml的完全培养基，用1000ml的枪头慢速均匀的吹打约120下，将制备成细胞悬液转移至提前加入3ml完全培养基的t25培养瓶，37℃，含95％o2、5％co2的培养箱继续培养。隔天更换一次完全培养基以促使细胞更好的生长。
[0049]
(3)细胞传代：显微镜下观察细胞汇合度达90％时，弃掉原培养液，pbs洗2遍并吸去残留的液体，加入0.25wt％胰蛋白酶溶液500μl覆盖瓶底消化30秒，显微镜下可见细胞变圆脱壁，晃动瓶底，可见脱落的细胞呈流沙状随液体流动而移动，立即加入2ml完全培养基终止消化，用巴氏吸管吸出含细胞的培养基转至10ml的离心管，反复吹打后1000rpm，离心5min，吸弃上层液加入3ml完全培养基反复吹打制备成单细胞混悬液，转移到新的25t细胞培养瓶中。八字摇匀培养瓶，使瓶内细胞均匀分布，随后置入37℃，含95％o2、5％co2的培养箱继续培养。
[0050]
(4)细胞冻存：细胞传代完成后，离心弃除上清液，加入1ml的细胞冻存液，按照梯度冻存法，依次将细胞冻存管放入4℃冰箱20min、-20℃冰箱40min后放入-80℃冻存。
[0051]
(5)细胞计数：湿酒精棉球擦拭干净计数板和盖玻片，晾干后，将盖玻片盖于计数板上。细胞消化离心后反复吹打培养液成单个细胞悬液。吸取10μl细胞悬液，沿盖玻片一侧轻轻滴加至计数板上，注意不可混入气泡，且细胞液不能溢出盖玻片。放入显微镜下计算计数板的四角大方格(每个大方格又分16个小方格)内的细胞数，只计算完整的细胞，若聚成一团则按一个细胞进行计数。如果有细胞位于线上，则计下线细胞不计上线细胞，计左线细胞不计右线细胞。二次重复计数误差不查过
±
5％。细胞悬液细胞数/ml＝4个大格细胞总数/4
×
104。
[0052]
1.4.2细胞衰老ogd/r模型的建立
[0053]
1.4.2.1细胞促衰实验方法
[0054]
取生长状态良好的sh-sy5y人神经母瘤细胞，给d-gal前一天，细胞以相同密度一次接种于6孔培养板中(细胞量2
×
104个/孔)，5％co2、37℃培养箱过夜，分别加入25mm d-gal、50mm d-gal、100mm d-gal、200mm d-gal、400mm d-gal，另设不加药物干预的control组，置培养箱继续培养48h，并进行各项不同指标的检测。
[0055]
1.4.2.2衰老sh-sy5y细胞ogd/r模型的建立
[0056]
①
按照1.4.2.1细胞促衰实验方法对细胞促衰后，取生长状态良好的sh-sy5y细胞，无菌条件下，用巴氏吸管吸掉原培养液，37℃预热的pbs洗1次，再用巴氏吸管吸净液体，加入37℃预热的无糖dmem培养液，将孔板盖子打开并放入高压灭菌过的缺氧盒内里，从盒顶小孔均匀流入99.9％高纯度氮气，流速保持在1l/min，5min后停止并快速密封缺氧盒，并转移到无co2的37℃恒温箱，继续培养，该过程称为缺糖缺氧处理。
[0057]
②
根据实验设计，缺氧不同时间点后，将细胞从密闭的缺氧盒里取出更在无菌条件下，用巴氏吸管吸净无糖dmem培养基更换为正常的dmem培养基(其中含有fbs，fbs在dmem培养基中的体积分数为10％)，37℃、5％co2的培养箱继续培养24h。完成衰老sh-sy5y细胞ogd/r模型的制备。
[0058]
1.4.3cck8检测细胞活性
[0059]
取生长状态良好的sh-sy5y神经母瘤细胞，给d-gal前一天，细胞以相同密度一次接种于96孔培养板中(细胞量104个/孔)，5％co2、37℃培养箱过夜，96孔板外周一圈加入蒸馏水缓解蒸发。次日加入25mm、50mm、100mm、200mm、400mm浓度的d-gal，与不加药物干预的control组，置培养箱继续培养48小时，按照cck8试剂说明书，用巴氏吸管吸净原培养基，并用37℃预热的pbs洗1遍，加入含cck8溶液的培养基100μl(cck8液10μl+无糖dmem培养基90μl)，操作过程需避光。置入37℃培养箱继续培养1h，在酶标仪450nm波长处测定各孔吸光度od值，实验重复3次。
[0060]
1.4.4细胞衰老β-半乳糖苷酶染色
[0061]
生长状态良好的sh-sy5y细胞按1.4.2实验步骤处理后，吸弃原培养基，pbs洗1遍，加入1mlβ-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15min，吸弃固定液，pbs洗3次，每孔加入1ml染色工作液，锡纸包住6孔板以避光，放入无co2的37℃恒温箱孵育过夜，普通光学显微镜下观察。
[0062]
1.4.5细胞增殖检测
[0063]
实验采用beyoclick
tm edu-488细胞增殖检测试剂盒(beyoclick
tm edu cell proliferation kit with alexa fluor 488)进行检测，实验原理是一种基于dna合成过程中胸腺嘧啶脱氧核苷(thymidine)类似物edu(5-ethynyl-2'-deoxyuridine)的掺入，并通过随后的点击反应(click reaction)使edu被alexa fluor 488所标记，具有简单、快速、高灵敏的特点。生长状态良好的sh-sy5y细胞按1.4.2实验步骤处理后，加入37℃预热的edu工作液，继续孵育6小时；吸净培养液，每孔加入1ml固定液，固定15min，去除固定液；用1mlpbs洗3遍后加入1ml通透液室温孵育15min；去除通透液后用1ml pbs洗2遍，加入0.5ml的click反应液，轻轻摇晃培养板以确保反应混合物均匀覆盖样本，室温孵育30min；吸弃click反应液，用pbs洗3遍，每孔加入hoechst33342溶液1ml，pbs洗3遍，立即到荧光显微镜下观察并拍照。其中细胞核染hoechst为蓝色荧光，增殖细胞为明亮的红色荧光。
[0064]
1.4.6流式细胞仪检测细胞周期的变化
[0065]
生长状态良好的sh-sy5y细胞按1.4.2实验步骤处理后，吸去培养液，用500μl pbs溶液洗涤培养孔后吸出并加入1.5ml离心管。用500μl的0.25wt％胰蛋白酶edta溶液消化细胞，并收集至1.5ml离心管中，1000g下离心3min，吸弃上清液的同时保留微量培养液以免吸去细胞。加入冰上预冷pbs缓冲液1ml重悬浮细胞，并再次离心。加入冰上预冷的体积分数为70％的乙醇水溶液500μl，轻轻吹打混匀，直到无成团的细胞。在4℃条件下固定细胞4h以上。1000g离心3min沉淀细胞。加入冰上预冷pbs缓冲液1ml重悬浮细胞，并再次离心。离心后重复一次重悬浮操作。轻轻弹动离心管底使细胞分散，避免细胞成团。向每管细胞样品中加入碘化丙啶染色液0.5ml，轻柔重悬浮细胞使其充分混匀，在37℃下避光孵育30min。将染色好的液体使用5ml细胞筛管过滤并收集滤液。流式细胞仪检测红色荧光信号(488nm激发波长)，并记录光散射数据。使用flowjo软件进行细胞周期分析并使用graphpad prism 8软件作图。
[0066]
1.4.7cck-8法检测不同缺氧时间衰老细胞的存活率
[0067]
生长状态良好的sh-sy5y细胞按1.4.2实验步骤处理后，将96孔板倾斜，小心吸弃培养基，每孔加入100μl pbs清洗细胞，吸去pbs，加入37℃预热的无糖dmem，按照1.4.2.2进行细胞缺氧缺糖处理，设置缺糖时间为0.5h、1h、1.5h、2h。之后，将无糖dmem换成完全培养基，37℃、5％co2恒温箱继续培养24h。吸弃培养基，每孔加入37℃预热的pbs洗1遍，加入含cck8溶液的培养基100μl(cck8液10μl+无糖dmem培养基90μl)，操作过程需避光。置入37℃培养箱继续培养1h，在酶标仪450nm波长处测定各孔吸光度od值，实验重复3次。
[0068]
1.5统计学分析
[0069]
实验数据均采用均数+标准差表示，使用graphpad prism8.0软件统计学分析与作图，计量资料用均数
±
标准误表示。两组均数比较用独立样本的t检验，3组以上的均数比较采用单因素方差(one-way anova)分析，当数据方差齐时，多组间的两两比较选择lsd检验，方差不齐时选用dunnett’s t3法。以p＜0.05视为有统计学意义。
[0070]
2实验结果
[0071]
2.1显微镜下观察不同d-gal浓度下细胞形态变化
[0072]
取生长状态良好的sh-sy5y神经母瘤细胞，给d-gal前一天，细胞以相同密度一次接种于6孔培养板中(细胞量105个/孔)，5％co2、37℃培养箱过夜，至细胞贴壁融合度达80％以上时，加入1ml含25mm、50mm、100mm、200mm、400mm浓度的d-gal完全培养基，另设不加药物
干预的control组，置培养箱继续培养48h，倒置相差显微镜下观察到细胞形态如图1所示，随着d-gal浓度的增大，贴壁细胞数量减少，有的细胞仍然贴壁，但出现肿胀且呈扁平状，细胞排列稀松，形态变异，胞体变小变圆，折光性增强甚至有的细胞间连接消失，提示d-gal浓度的在一定范围内对细胞影响不大，但浓度过大，会对细胞产生较大毒性。
[0073]
2.2cck8试剂检测细胞活性
[0074]
为了筛选d-gal合适致衰浓度，选用cck8试剂盒检测不同d-gal浓度梯度下作用时间48h后细胞活力的变化，结果见图2。实验显示：不同浓度的d-gal作用下，细胞存活率逐渐下降，其中25mm组细胞存活率(76.65
±
7)％、50mm组细胞存活率(63.45
±
9)％、100mm组细胞存活率(59.3
±
11)％、200mm组细胞存活率(48.2
±
11)％、400mm组细胞存活率(30.6
±
6)％。根据ic50，选择100mm的d-gal作用浓度。
[0075]
2.3细胞衰老β-半乳糖苷酶染色
[0076]
为了检测d-gal诱导48h后的细胞衰老情况，用β-半乳糖苷酶试剂盒对细胞进行染色，β-半乳糖苷酶是最常用的细胞衰老标志物。它可以催化底物x-gal，生成深蓝色产物，sa-β-gal染色法是细胞衰老的最有效的检测方法之一，也是检测衰老的金标准。倒置显微镜下蓝染的细胞是衰老细胞，不被染色的是普通细胞。实验结果如图3所示，d-gal诱导后明显增加β-半乳糖苷酶染色阳性率，并随着浓度的增加β-半乳糖苷酶染色阳性率增加，空白对照组染色阳性率为(5.47％
±
1.09)％，25mm的d-gal染色阳性率为(7.11
±
1.08)％，50mm染色阳性率是(7.74
±
3.35)％，100mm染色阳性率是(13.9
±
4.65％)，200mm染色阳性率是(19.88+1.453)％，400mm染色阳性率是(56.43+11.43)％。值得注意的是，100mm组蓝染阳性率明显减少，出现统计学差异(p《0.05)。结合细胞活力和sa-β-gal染色结果，选择100mm作为最终的造模浓度。
[0077]
2.4细胞增殖检测
[0078]
采用edu细胞增殖实验评估细胞增殖情况，在dna合成过程中，edu替代胸苷掺入到新的dna中，edu乙炔基与荧光标记的小分子叠氮化物探针通过一价铜离子催化发生共价反应，形成稳定的三唑环，增殖细胞在显微镜下呈现红色荧光，细胞核呈现蓝色。数据处理按control组为对照，结果如图4所示，25mm组增殖率为(94.89
±
9.48)％，50mm组增殖率(80.8
±
18.67)％，100mm组增殖率(72.24
±
22.81％)，200mm组增殖率(64.97
±
3.779)％，400mm组染色阳性率(38.37
±
15.81)％。由此可知，随着d-gal浓度的增加，细胞增殖率减少，且在100mm时开始出现统计学差异。
[0079]
2.5细胞周期的变化
[0080]
衰老细胞的一个共同特征是不可逆的细胞周期停滞，其中s期是dna合成期。我们对不同浓度下作用48h的细胞进行细胞周期检测，结果(图5)显示，各组细胞s期细胞占比不同，其中control组(28.63
±
0.41)％，50mm组(34.33
±
3.6)％，100mm组(26.8
±
0.55％)，200mm组(25
±
0.79)％，400mm组(19.13
±
9.9)％。由此可知，100mm可引起s期细胞周期停滞，且具体统计学意义(p《0.05)。利用graphpad prism8.0统计软件进行分析g0/g1，随着浓度的增加而细胞比例逐渐增加，特别是100mm组细胞周期g0/g1期细胞百分比(57.033
±
0.153)％明显高于control组(49.467
±
2.4)％，且具有统计学意义(p《0.05)。同时利用graphpad prism 8.0统计软件进行分析g2/m，g2/m期细胞逐渐减少，且100mm组细胞周期g2期细胞百分比(12.96
±
0.35)％明显低于control组(19.57％
±
0.7)％，且具有统计学意义
(p《0.05)。
[0081]
2.6不同缺氧缺糖时间细胞存活率的检测
[0082]
取已促衰老的生长状态良好的sh-sy5y细胞接种在96孔板内，每个组设置6个复孔，按照1.4.2.2的造模实验操作方法，分别经缺氧0.5h、1h、1.5h、2h后，复氧24h，进行细胞存活率检测。根据cck8细胞活性检测说明书，计算得到不同缺氧时间点的细胞存活率结果见图6，其中：缺氧0.5h细胞存活率为(94.1
±
2.8)％，缺氧1h细胞存活率为(53
±
1.6)％，1.5h细胞存活率为(41.8％
±
4.5)％，2h细胞存活率是(23.5
±
1.5)％。与control组相比，存活率随着缺氧时间的延长逐渐降低，且均具有统计学意义，通常认为细胞存活率在50％左右的时间段为药物治疗的最佳时间，因此选取缺氧缺糖1h作为后续研究。
[0083]
d-gal诱导的衰老模型常用于衰老研究。当细胞中d-gal浓度太高而无法被催化和代谢时，会导致细胞渗透、肿胀和高ros，这些变化超出氧化防御系统清除能力时，会导致代谢紊乱，并最终导致衰老。因本发明后续还需对细胞进行ogd/r二次打击，因此需要根据实验要求选择合适的浓度，不能参照常规的实验浓度。本发明发现细胞活力随d-gal浓度的升高而下降，特别是d-gal浓度为200mm及以上时，细胞活力急剧下降，出现明显细胞核缩小，细胞排列稀疏，细胞变圆或离壁甚至死亡。本发明使用细胞活力接近50％对应的100mm的d-gal作为后续细胞致衰浓度。
[0084]
衰老过程中，分裂的细胞逐渐失去增殖能力，并伴随独特的形态学变化和衰老特异性标志物的表达改变。细胞衰老的识别或量化主要通过细胞形态变化、sa-β-gal活性增加、生长抑制、细胞周期阻滞等改变来反映。衰老细胞的形态特征一般表现为体积增大，细胞核增大且形状不规则。观察起来很方便，作为检查指标。本发明实验发现随着d-gal作用48h浓度增加，细胞数量逐渐减少，特别在超过100mm时细胞形态明显分布稀散，甚至出现细胞死亡。衰老细胞在ph6.0时有高酶活性的β-半乳糖苷酶(sa-β-gal)表达，出现蓝色染色沉淀物，所以通过分析细胞阳性染色百分率可评价衰老趋势。本发明中，用不同剂量的d-gal(25、50、100、200、400)mm处理细胞48h，sa-β-gal染色率显著升高，且呈剂量依赖性。尽管sa-β-gal活性已被广泛用作衰老的经典标志，但研究表明，其活性可能在独立于衰老的条件下也升高。因此，本发明进一步分析是否可以在d-gal诱导的sh-sy5y细胞中观察到其他衰老标志物。细胞周期是连续分裂的细胞从上一次分裂完成到下一次分裂完成时为止的过程，被认为是控制正常细胞增殖和生物衰老的重要机制。衰老细胞停滞于g1/g0期，不能顺利进入s期，表现为s期细胞减少。本发明中的细胞周期结果显示随着d-gal浓度的升高，细胞被阻滞在g1期越来越多。s期在100mm时，出现转折，代表进入复制期的细胞数目大大减少，并具有统计学差异。本发明在edu实验中，通过增殖细胞/细胞核，很明显的看出增殖细胞的比例，同样发现100mm时开始出现统计学差异，说明细胞周期出现了明显的抑制，结果与流式细胞仪测的细胞周期结果复合。故本发明采用100mm d-gal作用48h作为后续实验研究。
[0085]
相对动物实验而言，细胞在培养过程中有研究样本均一、利于观察单一因素、研究条件人为可控等优势。目前离体细胞缺糖缺糖模型建立大体分为物理性和化学性缺氧两类，化学性缺氧是在细胞培养液中加入某种化学物质，如连二亚硫酸钠、氰化物，损伤细胞利用氧的能力或耗尽培养液的氧而造成细胞缺氧。化学性缺氧存在对细胞造成损伤、实验操作难控制等缺点。物理性缺氧模型是利用混合气体培养法来降低培养环境中氧气的比
例，从而模拟缺氧实验模型，通常有液面封闭模型、自制简易密封模型及三气培养箱模型。目前有广泛的技术用于产生缺氧条件，包括无氧培养箱、缺氧室手套箱或自制缺氧装置。氮气是惰性气体，通常采用氮气/二氧化碳混合气体来调节o2水平。本发明在培养皿中加入无糖培养液并把培养皿放入缺氧盒，尽量快速灌注氮气，且每次灌流的时间和气流大小保持一致。待氮气充满整个缺氧盒时，停止灌气并密封放入恒温孵化箱，达到细胞ogd的效果。实验中ogd损伤和复氧是两个阶段，从细胞层面先给予细胞ogd，以模拟脑缺血缺氧后神经损伤的状态，复氧是模拟再灌注的过程，一方面可以从形态学上观察细胞在数量、结构以及特征表型的变化，另一方面可以从生化、蛋白水平上探究脑缺血再灌注损伤的病理变化及药物作用机制。ogd/r持续时间和强度是评价神经保护潜力药物的关键参数。细胞死亡率在40％-60％之间是研究神经保护药物的最佳选择，因为在较高的细胞死亡值下，很难获得显著的神经保护。
[0086]
人体研究表明，在30至89岁脑血流量和耗氧量减少了25％-40％。所以老年大脑中的神经血管单位特别容易缺氧，其中神经元细胞最脆弱，会迅速死亡。在实验中，可以看到经过d-gal诱导的衰老细胞也表现出同样的特性，ogd/r后细胞活力大大降低。在ciri中，大脑会经历一系列“缺血性级联”事件，流向大脑的血液减少会降低营养、氧气和能量的可获得性，损耗神经细胞的活力。细胞损伤的程度取决缺血缺氧持续的时间和严重程度，所以衰老细胞的ogd模型需优化，本发明中sh-sy5y细胞活力随着ogd时间的延长而逐渐降低。参照本发明的sh-sy5y细胞ogd/r模型，统一复氧24h，实验发现ogd作用sh-sy5y细胞1h复氧24h，细胞存活率为(53
±
1.6)％，。本发明实验中发现缺氧2h的细胞活力仅为23.5％。可见老化的细胞在ogd/r后损伤更明显，因此，实验采用缺氧1h作为后续实验研究。
[0087]
综上，本发明首先用cck8法确定d-gal作用sh-sy5y细胞诱导衰老的浓度和时间，用细胞活力、细胞周期、细胞增殖检测以及sa-β-gal染色法验证细胞衰老，在此基础上用d-gal致衰老sh-sy5y细胞建立ogd/r模型，以cck8法确定衰老细胞ogd和复氧时间，最终确定衰老sh-sy5y细胞ogd/r模型构建中采用100mm d-gal致衰老48h后ogd 1h和复氧24h模式。
[0088]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。