一种番茄单粒种子携带番茄斑萎病毒TSWV的RT-PCR检测方法及其应用

一种番茄单粒种子携带番茄斑萎病毒tswv的rt-pcr检测方法及其应用
技术领域
1.本发明涉及农业技术领域，具体涉及一种番茄单粒种子携带番茄斑萎病毒tswv的rt-pcr检测方法及其应用。


背景技术：

2.番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt orthotospovirus，tswv)属于布尼亚病毒目(bunyavirales)番茄斑萎病毒科(tospoviridae)正番茄斑萎病毒属(orthotospovirus)。该病毒于1915年首次在澳大利亚发现报道，目前在世界范围内广泛分布，已被列为世界上危害最大的十种植物病毒之一，每年造成全球约10亿美元的作物损失。1989年tswv病毒被欧洲及地中海植物保护组织(european and mediterranean plantprotection organization，eppo)列入a2类检疫性有害生物。2006年中国将tswv列入新公布的全国农业植物检疫性有害生物名单中。
3.据统计，目前番茄斑萎病毒已在中国18个省、市、自治区番茄主产区发生流行，成为番茄上一种重要的病毒病害。tswv在番茄苗期可引起植株叶片黄斑、坏死及紫脉，整株萎焉及坏死，后期可引起番茄果实产生黄斑、环斑或坏死斑，严重影响果实产量及质量。
4.目前发现番茄斑萎病毒可通过传毒介体昆虫蓟马(thrips)以持久增殖方式进行传播。能传播番茄斑萎病毒的蓟马主要有：西花蓟马(frankliniella occidentalis)、花蓟马(f.intonsa)、烟蓟马(thrips tabaci)和棕榈蓟马(t.palmi)等。但除此之外，本研究团队经研究证实，tswv可通过种子携带病毒进行传播，并且通过对tswv流行病学的研究，发现种子带毒是一个非常重要的初侵染源。
5.种子带毒是tswv远距离传播的重要途径。带毒种子在田间作为初侵染源，通过介体因素进行二次传播，进而造成严重损失。因此，建立健全番茄斑萎病毒的种子病毒检测方法，对种子上的番茄斑萎病毒进行快速、灵敏及准确的检测鉴定，准确、高灵敏度的鉴定检测，对于从源头上控制该病毒的扩散蔓延具有重要的指导意义。
6.早期的病毒检测主要以生物学鉴定及电镜检测技术为主。生物学鉴定存在耗时长、工作量大，准确性低的问题。电镜检测可直观地观察病毒的形态、大小、表面结构等。但对设备条件要求高，需专业人员操作，不适合于大规模检测。血清学检测是一种快速、应用范围交广的检测技术。其中应用最广泛的是酶联免疫吸附法(elisa)，其原理基于抗原-抗体特异性结合的免疫反应，再进一步通过显色底物进行显色反应进而判断样品中是否含有抗原。血清检测具有操作简单、快速、特异性强等特点。rt-pcr是基于聚合酶链式反应的一种体外dna扩增技术，其原理是通过反转录酶将病毒rna反转录成cdna，进一步通过聚合酶链式反应，以cdna为模板，加入引物及4种脱氧核苷酸，在dna聚合酶的酶促条件下，复制出大量特定基因片段。rt-pcr是从核酸水平检测病毒，具有准确、灵敏、快速等特点。
7.目前，尚缺乏快速精确检测番茄单粒种子携带番茄斑萎病毒的分子检测方法。


技术实现要素：

8.针对现有技术的问题，本发明提供了一种快速准确检测番茄单粒种子携带番茄斑萎病毒tswv的分子检测技术方法。应用该检测方法，可以精确计算番茄种子的带毒率，为番茄种子携带tswv病毒的快速检测及科学防控提供技术支持。
9.为了解决现有技术的问题，本发明提供了如下技术方案：本发明的一种番茄单粒种子携带番茄斑萎病毒tswv的rt-pcr检测方法，包括如下步骤：(1)种子样品前处理：将单粒番茄种子放入离心管，液氮速冻，放入钢珠，液氮速冻后使用全自动组织研磨仪进行批量研磨处理；(2)rna提取；(3)rt-pcr检测。
10.进一步地，在步骤(1)中，种子样品前处理：将单粒番茄种子放入1.5ml离心管，液氮速冻，放入1～2颗5mm灭菌处理的钢珠，液氮速冻后使用全自动组织研磨仪进行批量研磨处理；研磨仪设置频率为60hz，研磨时间为2～3min。
11.进一步地，在步骤(2)中，研磨好的样品中加入1ml trizol试剂后用常规trizol试剂法提取病毒rna，或使用植物rna提取试剂盒按照使用说明书提取的总rna用于rt-pcr分子检测。
12.更进一步地，在步骤(3)中，将总rna在65℃条件下变性处理5min，后加入5
×
easy quick rt master mix 2μl，rna template 6μl，rnase-free water 2μl，配制成10μl反应体系进行反转录，反转录条件为37℃孵育15分钟，85℃孵育5秒钟；反转录后使用2
×
taq master mix(康为，中国)进行pcr反应，pcr扩增的引物为：tswvn-f：5
′‑
atgtctaaggttaagctcactaagg-3
′
，tswvn-r：5
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ttaagcaagttctgcaagttttgtc-3
′
。
13.进一步地，在步骤(3)中，扩增目的片段大小为777bp，反应体系为20μl，2
×
taq master mix 10μl，cdna template 3μl，rnase-free water 6μl，tswv n-f 0.5μl，tswv n-r 0.5μl；预变性温度98℃，时间10s；变性温度98℃，时间10s；退火温度55℃，时间40s；延伸温度72℃，时间30s；30循环；终止延伸温度72℃，时间5min。
14.本发明所述的番茄种子携带番茄斑萎病毒tswv的带毒率检测中的应用。
15.本发明所述的检测方法适用于快速检测番茄种子中携带的番茄斑萎病毒tswv，计算番茄种子带毒率，为番茄种子携带tswv病毒的快速检测及科学防控提供技术支持。
16.有益效果：本发明该检测技术具有高灵敏性及特异性，能够快速特异检测单粒番茄种子中携带的番茄斑萎病毒tswv。针对番茄单粒种子携带tswv病毒的rt-pcr检测的方法，检测结果真实可靠，可以精确计算番茄种子的带毒率，为番茄种子携带tswv的大规模检测及科学防控提供技术支撑，对从种子源头控制该病害在田间的流行爆发有重要意义。
附图说明
17.图1为本发明的rt-pcr引物特异性检测图；(m：marker；1：阴性对照；2：tswv阳性样品；3：空白对照；4：tobrfv阳性样品；5：tocv阳性样品；6：tylcv阳性样品；7：pvy阳性样品)。
18.图2为本发明的种皮与种胚带毒率的rt-pcr检测图；(m：marker；1：阴性对照；2：tswv阳性样品；3：空白对照；4～8：待检番茄种子种胚；9～13：待检番茄种子种皮)。
19.图3为本发明的番茄商品种子带毒率的rt-pcr检测图。(m：marker；1：阴性对照；2：tswv阳性对照；3：空白对照；4～9：商品化番茄种子d；10～15：商品化番茄种子e；16～20：商品化番茄种子f)。
具体实施方式
20.下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
21.实施例1
22.本发明的一种番茄单粒种子携带番茄斑萎病毒tswv的rt-pcr检测方法，包括如下步骤：(1)种子样品前处理：将单粒番茄种子放入1.5ml离心管，放入1～2颗5mm灭菌处理的钢珠，液氮速冻后使用全自动组织研磨仪进行批量研磨处理；研磨仪设置频率为60hz，研磨时间为2～3min；(2)rna提取：研磨好的样品中加入1ml trizol试剂后用常规trizol试剂法提取病毒rna，或使用植物rna提取试剂盒按照使用说明书提取的总rna用于rt-pcr分子检测。(3)rt-pcr检测：将总rna在65℃条件下变性处理5min，后加入5
×
easy quick rt master mix 2μl，rna template 6μl，rnase-free water 2μl，配制成10μl反应体系进行反转录，反转录条件为37℃孵育15分钟，85℃孵育5秒钟；反转录后使用2
×
taq master mix(康为，中国)进行pcr反应，pcr扩增的引物为：tswv n-f：5
′‑
atgtctaaggttaagctcactaagg-3
′
，tswvn-r：5
′‑
ttaagcaagttctgcaagttttgtc-3
′
。扩增目的片段大小为777bp。反应体系如表1所示：
23.表1
[0024][0025]
预变性温度98℃，时间10s；变性温度98℃，时间10s；退火温度55℃，时间40s；延伸温度72℃，时间30s；30循环；终止延伸温度72℃，时间5min。
[0026]
结果判断：分别将rt-pcr的扩增产物、500bp dna marker、以及tswv的阳性对照、阴性对照、空白对照5μl样品点入1.2％琼脂糖凝胶胶孔，120v电压，80ma电流条件下进行琼脂糖凝胶电泳。待样品跑至胶板2/3处时，停止电泳，用凝胶成像仪进行观察拍照。在tswv阳性对照扩增出目的条带，阴性及空白对照无扩增条带情况下，如果待检样品扩增条带与阳性大小一致时，则待检样品判断为阳性；如果当tswv阳性扩增出目的条带，阴性无条带，而待检样品无条带时，则待检样品判断为阴性。如果tswv阳性无条带或阴性扩增出目的条带，则实验无效。
[0027]
本发明所述的方法适用于番茄种子携带番茄斑萎病毒tswv带毒率检测的应用。
[0028]
试验例1
[0029]
引物特异性检测
[0030]
用tswvn特异性引物对番茄上常见的病毒：番茄斑萎病毒、番茄褐色皱纹果病毒(tomato brown rugose fruit virus，tobrfv)、番茄褪绿病毒(tomato chlorosis virus，
tocv)、番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl virus，tylcv)、马铃薯y病毒(potato virus y，pvy)阳性对照、健康对照、及待检样品进行rt-pcr检测，检测方法根据实施例1所示，检测结果见图1，褐色皱纹果病毒、番茄褪绿病毒、番茄黄化曲叶病毒阳性对照及健康对照样本无目的片段条带，tswv阳性对照及待检样本出现特异性目的片段条带。将待检样本扩增出的条带进行测序，经ncbi blast比对，比对到tswv病毒的最高同源性为99％以上，说明引物特异性良好，能够特异性检测出tswv病毒。
[0031]
试验例2
[0032]
番茄种皮及种胚带毒率比较
[0033]
取5粒tswv病果番茄种子分别放入1.5ml离心管中，加入100μl灭菌的蒸馏水，浸泡过夜。将每颗番茄种子的种皮用手术刀片轻轻划开，辅以电镜镊子将种皮与种胚分开。分别收集种胚及种皮，放入1.5ml离心管，无菌蒸馏水清洗3次后，在分别放有番茄种胚和种皮的1.5ml离心管中加入2颗5mm钢珠，液氮速冻后，使用全自动组织研磨仪研磨成粉状，加入trizol提取总rna。总rna提取后根据实施例1进行rt-pcr检测，检测结果如图2所示，阳性对照出现目的条带，阴性对照及空白无目的条带，5棵番茄种子中有5个种皮检测到tswv，检出率为100％，2个种胚检测到tswv，检出率为40％。种皮tswv的检出率要高于种胚中的检出率。
[0034]
试验例3
[0035]
对不同批次来源番茄商品种子进行rt-pcr带毒率检测
[0036]
根据实施例1的方法对不同生产厂家的6粒番茄种子进行tswv带毒率检测。检测结果如图3所示，商品化种子d的tswv检测率为0％，商品化种子e的检出率为40％，商品种f的检出率为20％。
[0037]
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。