一种促进干细胞增殖和收集干细胞外泌体的方法与流程

1.本发明属于干细胞领域，涉及干细胞培养和外泌体制备，具体涉及一种促进干细胞增殖和收集干细胞外泌体的方法。


背景技术：

2.外泌体(exo)是一种可由大多数细胞释放的囊泡样物质，直径约40～160nm。它起源于内吞途径：细胞质膜内吞形成早期内体，早期内体可发育为晚期内体，晚期内体向内出芽形成管腔囊泡并成为多泡体，部分多泡体与细胞质膜融合，释放的管腔囊泡即是外泌体。多泡体的发生过程使得外泌体最终含有与来源细胞相关的核酸和蛋白质，这是外泌体发挥与来源细胞相似生理功能的必要条件。
3.间充质干细胞(mscs)是一种具有自我更新、多向分化能力的成体干细胞，首先从骨髓中分离出来，随后发现从骨膜、脂肪、肌肉、胎盘、脐带、脐带血中也可分离和制备mscs。早期认为mscs对损伤的修复是基于分化替代，进一步研究则发现mscs体内存留时间短，静脉注射mscs多数滞留于肺、脾等脏器，因此msc的旁分泌作用被日渐关注。研究发现，mscs外泌体(mscs-exo)能够起到mscs相似的生理作用，可改善细胞功能和表型、调节免疫系统等而达到治疗疾病的目的。
4.目前，mscs-exo的收集制备效率较低。提高mscs-exo制备效率通常从两个角度：一、提高mscs的增殖效率，提高细胞基数；二、提高mscs的分泌效率，提高单位量细胞的mscs-exo分泌能力。相比较而言，第一个角度实现的手段较为丰富。
5.本发明即为从第一个角度解决mscs-exo收集制备效率较低的不足。


技术实现要素：

6.本发明是为了克服现有技术的缺陷和不足，提供一种促进干细胞增殖和收集干细胞外泌体的方法，提高干细胞培养、收集干细胞外泌体的效率。
7.本发明上述目的通过如下技术方案实现：
8.fgl1抑制剂在促进干细胞体外增殖中的应用，所述干细胞为脐带间充质干细胞。
9.优选地，所述fgl1抑制剂为抑制fgl1表达的sirna。
10.一种收集干细胞外泌体的方法，包括如下步骤：
11.步骤s1，收集经fgl1抑制剂处理的脐带间充质干细胞，用含10％无外泌体的胎牛血清、1％青链霉素的dmem/f12培养基于37℃、5％co2饱和湿度条件下培养48h，收集上清液；
12.步骤s2，300
×
g离心10min，弃去沉淀，收集上清液；
13.步骤s3，2000
×
g离心10min，弃去沉淀的死细胞，收集上清液；
14.步骤s4，10000
×
g超速离心30min，弃去细胞碎片，收集上清；
15.步骤s5，使用0.22μm的过滤器过滤上清；
16.步骤s6，100000
×
g超速离心70min，弃去上清，收集沉淀；pbs重悬沉淀，再次
100000
×
g超速离心70min，弃去上清，收集沉淀，即获得外泌体。
17.优选地，所述fgl1抑制剂为抑制fgl1表达的sirna。
18.技术效果：
19.本发明用实验证明fgl1被抑制的脐带间充质干细胞在体外具有更强的增殖活性，依然维持良好的多向分化能力，分泌的外泌体符合干细胞外泌体的特点。因此，fgl1抑制剂可以用于促进脐带间充质干细胞体外增殖，进而提高获取间充质干细胞外泌体的效率。
附图说明
20.图1为脐带间充质干细胞在倒置显微镜下观察到的形态图；
21.图2为各组脐带间充质干细胞中fgl1蛋白的表达水平；
22.图3为sirna组脐带间充质干细胞在成骨、成脂诱导分化培养基的诱导培养下分别定向产生了成骨、成脂分化的结果图；
23.图4为sirna组脐带间充质干细胞分泌的外泌体的鉴定结果；其中，a为透射电镜下观察到的外泌体形态，b为外泌体表面标志cd9、cd63和cd81的表达，c为外泌体的粒径分布，均符合干细胞外泌体的特点。
具体实施方式
24.一、实验材料
25.胎牛血清、dmem/f12培养基购自gibco公司。青链霉素购自sigma公司。
26.无外泌体的胎牛血清购自美国sbi。
27.流式测定使用的标记的cd44、cd90、cd73、cd105、cd34、cd45购自bd公司。
28.fgl1 sirna、sirnanegative control及rt-pcr引物由上海吉凯基因设计合成。
29.lipofectamine
tm 3000购自thermo fisher scientific公司。
30.trizol试剂、onestep rt-pcrkit试剂盒购自thermo fisher scientific。
31.fgl1、gapdh一抗、二抗以及cck-8试剂购自碧云天生物科技。
32.人脐带间充质干细胞成骨、成脂诱导分化培养基购自武汉普诺赛生命科技有限公司。
33.二、实验方法
34.1、脐带间充质干细胞分离培养
35.取足月顺产的新生儿脐带，剥离动脉和静脉血管，剪成约1mm3大小的组织块。将组织块铺在25cm2培养瓶中，加入含10％胎牛血清、1％青链霉素的dmem/f12培养基，置37℃，5％co2饱和湿度条件下培养，细胞爬出融合约60％时，弃去组织块，待细胞融合约90％时，胰蛋白酶消化，待镜下观察细胞收缩并悬浮时加入dmem/f12培养基终止消化，收集细胞悬液，1000
×
g离心8min，收获沉淀，加入完全培养基重悬。将原代细胞1:1传代至新的培养瓶中，即为第1代人脐带间充质干细胞，每3d换液1次，当细胞融合约90％时胰酶消化，按1:2传代，即为第2代、第3代，以此类推。取第4代人脐带间充质干细胞，倒置显微镜下观察细胞形态并拍照；用流式细胞仪对细胞表型进行鉴定，cd44、cd90、cd73、cd105抗原阳性表达且cd34、cd45抗原阴性表达，进行后续实验。
36.2、分组和转染
37.将第4代脐带间充质干细胞用含10％胎牛血清、1％青链霉素的dmem/f12培养基于37℃、5％co2饱和湿度条件培养，取生长状态良好的细胞，随机分为：sirna组(转染fgl1sirna)、sirna-nc组(转染sirnanegative control)、blank组(不转染)。转染操作按照lipofectamine
tm 3000说明书进行，转染6h后更换新鲜培养基，转染48h进行后续实验。
38.3、fgl1 mrna表达水平测定
39.先用trizol法提取各组脐带间充质干细胞总rna。根据onestep rt-pcr kit试剂盒说明书进行rna反转以及pcr扩增，pcr扩增反应体系如下：5
×
qiagen one step rt-pcr buffer 10μl，dntp mix 2μl，上下游引物各1μl，rna 1μg，qiagen one step rt-pcr enzyme mix 2μl，rnase-free water补足50μl。pcr反应条件：95℃预变性5min，之后95℃、10s，60℃退火40min，共40个循环。以gapdh为内参，按照2
—
△△
ct
法计算各组人脐带间充质干细胞中fgl1 mrna相对表达水平。
40.引物序列如下：
41.fgl1上游引物：5
’‑
gctggtggtttaacaggtgtc-3’42.fgl1下游引物：5
’‑
agaataccaccacccatgcc-3’43.gapdh上游引物：5
’‑
agaagactgtggatgg-3’44.gapdh下游引物：5
’‑
agctcagggatgaccttg-3’45.4、fgl1蛋白表达水平测定
46.提取各组脐带间充质干细胞总蛋白，测定蛋白浓度，上样于sds-page凝胶中进行电泳，转膜，5％脱脂奶粉室温封闭1h。分别加入fgl1、gapdh一抗的抗体稀释液4℃孵育过夜，加入二抗稀释液室温孵育1h，随后进行ecl测定。
47.5、cck-8法测定细胞增殖活性
48.将各组脐带间充质干细胞接种于96孔培养板中，5
×
103个/孔，用含10％胎牛血清、1％青链霉素的dmem/f12培养基于37℃、5％co2饱和湿度条件下培养，每组设5个重复孔。48h后，各孔加入10μl cck-8溶液，于37℃、5％co2饱和湿度条件下继续培养2h，应用酶标检测仪于450nm波长处检测各孔吸光度值。
49.6、多向分化能力测定
50.取sirna组脐带间充质干细胞，消化后以5
×
104个/孔的细胞密度接种于6孔板中，每孔加入2ml成骨诱导液(武汉普诺赛生命科技有限公司提供的商品化人脐带间充质干细胞成骨诱导分化培养基)，期间每隔3d更换1次诱导液，第14天进行茜素红染色，显微镜下观察矿化结节形成情况。取sirna组脐带间充质干细胞，消化后以5
×
104个/孔的细胞密度接种于6孔板中，每孔加入2ml成脂诱导液(武汉普诺赛生命科技有限公司提供的商品化人脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养基)，期间每隔3d更换1次诱导液，第14天进行油红o染色，显微镜下观察脂滴。
51.7、外泌体提取和鉴定
52.采用常规的超速离心法提取sirna组脐带间充质干细胞的外泌体，具体步骤如下：
53.步骤s1，收集sirna组脐带间充质干细胞，用含10％无外泌体的胎牛血清、1％青链霉素的dmem/f12培养基于37℃、5％co2饱和湿度条件下培养48h，收集培养上清液；
54.步骤s2，300
×
g离心10min，弃去沉淀，收集上清液；
55.步骤s3，2000
×
g离心10min，弃去沉淀的死细胞，收集上清液；
56.步骤s4，10000
×
g超速离心30min，弃去细胞碎片，收集上清；
57.步骤s5，使用0.22μm的过滤器过滤上清；
58.步骤s6，100000
×
g超速离心70min，弃去上清，收集沉淀；pbs重悬沉淀，再次100000
×
g超速离心70min，弃去上清，收集沉淀，即获得外泌体。
59.取适量外泌体，pbs重悬，bca法测定外泌体浓度。透射电镜观察外泌体形态。western blot检测外泌体表面标志cd9、cd63和cd81表达。粒径分析仪测定粒径分布。
60.8、统计学处理
61.实验数据采用spss 20.0软件进行分析。实验数据以均数
±
标准差表示，两组数据比较采用t检验，多组数据比较采用单因素方差分析。p＜0.05为差异有统计学意义。
62.三、实验结果
63.1、人脐带间充质干细胞分离培养结果
64.倒置显微镜下观察到的人脐带间充质干细胞形态如图1所示，呈长梭形，旋涡状生长，符合人脐带间充质干细胞的生长特点；cd44、cd90、cd73、cd105抗原阳性表达且cd34、cd45抗原阴性表达，符合人脐带间充质干细胞的表型特点。
65.2、fgl1 mrna、fgl1蛋白表达水平
66.各组脐带间充质干细胞中fgl1 mrna的相对表达水平见表1。与blank组比，sirna组脐带间充质干细胞中fgl1 mrna表达水平显著下调。
67.表1fgl1 mrna相对表达水平
[0068][0069]
各组脐带间充质干细胞中fgl1蛋白的表达水平如图2。与blank组比，sirna组脐带间充质干细胞中fgl1蛋白表达水平显著下调。
[0070]
该结果说明，sirna转染进脐带间充质干细胞后成功实现了对fgl1的抑制。
[0071]
3、细胞增殖活性
[0072]
各组吸光度值如表2所示，与blank组相比，sirna组吸光度值显著升高，说明fgl1被抑制的脐带间充质干细胞具有明显更强的增殖活性。
[0073]
表2各组吸光度值
[0074][0075]
4、多向分化能力
[0076]
结果如图3所示，sirna组脐带间充质干细胞在成骨、成脂诱导分化培养基的诱导培养下分别定向产生了成骨、成脂分化。该结果说明，fgl1被抑制的脐带间充质干细胞维持良好的多向分化能力。
[0077]
5、外泌体提取和鉴定
[0078]
图4中a为透射电镜下观察到的外泌体形态，b为外泌体表面标志cd9、cd63和cd81的表达，c为外泌体的粒径分布，均符合干细胞外泌体的特点。
[0079]
上述实验结果说明，fgl1被抑制的脐带间充质干细胞在体外具有更强的增殖活性，依然维持良好的多向分化能力，分泌的外泌体符合干细胞外泌体的特点。因此，fgl1抑制剂可以用于促进脐带间充质干细胞体外增殖，进而提高获取间充质干细胞外泌体的效率。
[0080]
上述实施例仅仅用于具体介绍本发明实质性内容，但不能以此限定本发明的保护范围。