牛源化鼠抗布鲁氏杆菌抗体及其制备方法与应用

本发明属于生物制药，具体涉及的是一种牛源化鼠抗布鲁氏杆菌抗体及其制备方法与应用。

背景技术：

1、布鲁氏菌病(brucellosis)属于重大人畜共患传染病，对人和动物的危害都极大，与狂犬病、非典型肺炎、高致病性禽流感等同属于乙类传染病。目前布鲁氏杆菌疫苗均为活疫苗，不仅对人与动物均有一定的致病作用，而且在免疫动物后会干扰血清学检测并引起孕畜流产，所以目前动物布鲁氏杆菌病的防控以净化为主，同时限制布氏杆菌疫苗的使用范围在一类地区，且不能对种畜与奶畜使用，这导致全国大部分地区只能通过监测与捕杀来达到疫病的净化。因此目前亟需一种能够在动物体内拮抗并阻碍布鲁氏杆菌传播的有效手段。

2、单克隆抗体制剂是一种有效的体内拮抗病原体的技术手段，但目前单克隆抗体技术在临床治疗应用中的进展较为缓慢，其主要原因在于单克隆抗体大多是鼠源性的，而鼠源性单克隆抗体应用于其他动物或人类治疗时存在诸多问题：一是不能有效地激活机体补体和fc受体相关的效应系统；二是被机体免疫系统所识别，产生抗原反应，并在机体循环系统中被很快清除掉。因此，为了保持单克隆抗体的抗体活性并减少或消除抗原活性，使用鼠源抗体的fab片段与靶动物抗体的fc片段嵌合成完整而有活性的嵌合抗体技术得到了发展。嵌合抗体或对抗体进行靶动物化改造的主体思路是以靶动物的igg为模板，将hv及lv区域上保留fr片段，而将cdr片段替换为相应鼠源片段，这样既保留了抗体的活性，又保证了抗体分子最大程度的靶动物相似性，可以在体内发挥理想的作用。

3、近年来，布鲁氏杆菌外模蛋白omp25成为了研究热点，研究发现omp25蛋白在布鲁氏杆菌感染、致病过程中发挥重要作用，且参与维持细菌的外模功能性结构的稳定，与病原菌在宿主内体繁殖生长过程有关，具备重要免疫原性与抗原保护作用。因此，借助生物信息学分析等手段，寻找布鲁氏杆菌外膜蛋白omp25有临床意义的抗原表位，制备单克隆抗体并进行靶动物化改造，即可得到同时具备良好分子活性与靶动物一致性的单克隆抗体。利用该抗体制备成体内注射制剂，将有效改善布鲁氏杆菌病的防控与治疗现状，对布鲁氏杆菌病的防控与净化以及公共卫生安全具有重要意义。

4、公开号为cn113354742a的发明专利公开了一种布鲁氏杆菌基因工程亚单位疫苗及其制备方法和应用，具体为一种原核表达的布鲁氏杆菌外膜蛋白的串联表位蛋白；该布鲁氏杆菌外膜蛋白串联表位蛋白的氨基酸序列由牛种omp25蛋白、犬种omp25蛋白、猪种omp25蛋白、绵羊睾丸种omp25蛋白、羊种omp31蛋白等16种蛋白的氨基酸序列组成；与本专利相比，该串联表位蛋白的氨基酸序列组成更为复杂。

技术实现思路

1、本发明的目的之一在于提供一种布鲁氏杆菌外膜蛋白omp25串联表位蛋白，该布鲁氏杆菌外膜蛋白omp25串联表位蛋白的氨基酸序列由牛种omp25蛋白、犬种omp25蛋白、绵羊睾丸种omp25蛋白的氨基酸序列组成。

2、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、布鲁氏杆菌外膜蛋白omp25串联表位蛋白，所述布鲁氏杆菌omp25蛋白串联表位蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。

4、进一步，所述布鲁氏杆菌omp25蛋白串联表位蛋白的核苷酸序列如seq id no.2所示。

5、进一步，所述布鲁氏杆菌外膜蛋白omp25串联表位蛋白的氨基酸序列由牛种omp25蛋白、犬种omp25蛋白、绵羊睾丸种omp25蛋白的氨基酸序列组成。

6、进一步，所述布鲁氏杆菌外膜蛋白串联表位蛋白的氨基酸序列由牛种omp25蛋白的4-46位、143-187位，犬种omp25蛋白的79-130位和绵羊睾丸种omp25蛋白的20-55位氨基酸序列组成。

7、本发明的目的之二在于提供一种表达布鲁氏杆菌外膜蛋白omp25串联表位蛋白的重组质粒。

8、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

9、表达布鲁氏杆菌外膜蛋白omp25串联表位蛋白的重组质粒，所述重组质粒包含所述布鲁氏杆菌外膜蛋白omp25串联表位蛋白的核苷酸序列。

10、本发明的目的之三在于提供一种基因工程菌株。

11、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

12、基因工程菌株，所述基因工程菌株含有表达布鲁氏杆菌外膜蛋白omp25串联表位蛋白的重组质粒。

13、进一步，将所述重组质粒转化宿主菌构建基因工程菌株，所述基因工程菌株经鉴定后制备布鲁氏杆菌外膜蛋白串联表位蛋白基因工程菌株种子株，所述宿主菌为大肠杆菌bl21菌株。

14、进一步，所述基因工程菌株的鉴定方法为：将所述基因工程表达菌株用lb培养基在37℃条件下震荡培养至对数期，然后在lb培养基内添加终浓度为1mm的iptg并继续培养2-3小时。离心收集菌体沉淀，用冰冷的pbs缓冲液按1：10(w/v)比例重悬菌体后，再离心收集菌体沉淀，重复2-3次，去除培养基成分。菌体通过sds-page电泳检测，与未转化的大肠杆菌bl21宿主菌相比，在20kd处有明显条带。

15、本发明的目的之四在于提供一种杂交瘤细胞。

16、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

17、杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞可分泌表达鼠抗布鲁氏杆菌外膜蛋白串联表位蛋白omp25抗体。

18、本发明的目的之五在于提供一种牛源化鼠抗omp25串联表位蛋白抗体。

19、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

20、一种牛源化鼠抗omp25串联表位蛋白抗体，所述抗体的氨基酸序列包含鼠抗omp25串联表位蛋白igg vh区cdr区氨基酸片段和vl区cdr区氨基酸片段。

21、进一步，所述抗体包含牛源igg免疫球蛋白h链和l链。

22、进一步，所述抗体包含牛源igg免疫球蛋白hv区fr1、fr2、fr3片段，以及lv区fr1、fr2、fr3片段，并含有以下突变的氨基酸残基：hv区fr1片段3位k-q、19位r-k；hv区fr2片段9位a-g、13位m-v、14位a-g；hv区fr3片段13位n-d、17位i-t、18位l-a、32位t-a；lv区fr1片段22位s-t；lv区fr2片段8位g-k、10位v-p；lv区fr3片段17位l-f、24位q-p、25位g-e。

23、进一步，所述抗体的hv链的氨基酸序列如seq id no.3所示；所述抗体的lv链氨基酸序列的氨基酸序列如seq id no.5所示。

24、进一步，所述抗体的hv链的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述抗体的lv链氨基酸序列的核苷酸序列如seq id no.6所示。

25、进一步，所述抗体的cdr1片段h链氨基酸序列如seq id no.8所示，l链氨基酸序列如seq id no.9所示；cdr2片段h链氨基酸序列如seq id no.10所示，l链氨基酸序列如seqid no.11所示；cdr3片段h链氨基酸序列如seq id no.12所示，l链氨基酸序列如seq idno.13所示。

26、本发明的目的之六在于提供一种表达所述牛源化鼠抗omp25串联表位蛋白抗体的重组真核表达载体。

27、进一步，通过人工合成方法，将具备如seq id no.4和seq id no.6所示的核苷酸序列的dna片段添加dna linker，并克隆到pcdna3.1载体的多克隆位点中，即为本发明牛源化鼠抗omp25串联表位蛋白抗体的pcdna3.1真核表达载体。

28、进一步，所述dna lingker的核苷酸序列如seq id no.7所示。

29、本发明的目的之七在于提供一种利用所述重组真核表达载体转染的细胞。

30、进一步，将重组真核表达载体转化表达细胞并培养，培养物经过纯化后即可得到所述牛源化鼠抗布鲁氏杆菌抗体。

31、进一步，所述重组真核表达载体为pcdna3.1载体；所述表达细胞为vero细胞。

32、选用vero细胞为靶细胞，采用脂质体法将人工合成的重组真核表达载体转染vero细胞，然后筛选稳定高表达的细胞系。具体步骤如下：1)在35mm孔中，加入重组真核表达载体1.5μg；2)加入5μl optimem配制的脂质体，室温孵育45min。然后加入到被optimem润洗过的宿主细胞中，孵育5h；离心去除载体-脂质体混合物，并向细胞中加入dmem进行培养；3)通过加压筛选表达bmabru单克隆抗体的细胞株。

33、本发明的目的之八在于提供一种所述牛源化鼠抗omp25串联表位蛋白抗体和/或目的七所述的细胞在制备用于预防和/或治疗布鲁氏杆菌病的药物中的应用。

34、本发明的目的之九在于提供一种所述牛源化鼠抗omp25串联表位蛋白抗体在制备用于阻断和抑制牛种、犬种、绵羊睾丸种布鲁氏杆菌的繁殖和扩散的药物中的应用。

35、本发明的目的之十在于提供一种牛源化鼠抗omp25串联表位蛋白抗体制剂。

36、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

37、一种牛源化鼠抗omp25串联表位蛋白抗体制剂，所述制剂含有所述牛源化鼠抗omp25串联表位蛋白抗体。

38、进一步，所述牛源化鼠抗omp25串联表位蛋白抗体制剂可在动物体内阻断并抑制牛种(b.abortus)、犬种(b.canis)、绵羊睾丸种(b.ovis)布鲁氏杆菌的繁殖和扩散。

39、进一步，所述牛源化鼠抗omp25串联表位蛋白抗体制剂为注射剂型，其制备方法为：将纯化的bmabru单克隆抗体原液进行过滤除菌，用无菌生理盐水调整浓度为50μg/ml，并添加终浓度为15μg/ml的葡萄糖，溶液装入无菌西林瓶，封口后放2-8℃备用。

40、所述bmabru单克隆抗体的纯化方法为：反复冻融细胞培养物，并收集全部细胞培养液，4℃、12000g条件下离心30min去掉杂质。上清液用已经由ph6.5-7.5的pbs平衡的protein g亲和层析填料进行层析纯化，洗脱液为含0.2-0.5m氯化钠、ph6.5-7.5的pbs，洗脱峰即为bmabru原液，即抗体原液。

41、本发明的有益效果在于：

42、1.本发明的牛源化鼠抗omp25串联表位蛋白抗体，注射剂型外观见均一，无异味和染菌，且无热原、异常毒性和急性毒性反应，具有安全性；通过elisa方法，用羊抗鼠igg(gam-igg)检测结果呈阴性、用羊抗牛igg(gah-igg)检测效价可达到1:12800以上，该抗体具有良好的免疫原性。

43、2.本发明的牛源化鼠抗omp25串联表位蛋白抗体可在动物体内阻断并抑制牛种、犬种、绵羊睾丸种布鲁氏杆菌的繁殖与扩散。

44、3.本发明的牛源化鼠抗omp25串联表位蛋白抗体可以产生较好的保护效果，保护率在90％以上。