一种含orf79的核雄性不育保持系的转育系统及其应用的制作方法

本发明涉及基因工程，尤其涉及一种含orf79的核雄性不育保持系的转育系统及其应用。

背景技术：

1、现有技术在育种过程中常利用杂种优势培养性状优于双亲的后代，其一般是利用雄性不育系材料进行后续的育种，以保持杂交种纯度，目前有采用核质互作不育系和光温敏不育系进行大范围农作物的杂交育种，但是两者存在如配组不自由、育性不够稳定等，还不能充分发挥杂交作物的育种潜力。

2、隐性核雄性不育的雄性育性仅受一对隐性核基因控制，且由于其基因为非常稀有的隐性突变，绝大多数品种的基因组上述位点为野生型的显性基因，故理论上几乎任何品种都可以作为隐性核雄性不育的恢复系与其杂交产生可育后代(杂交种)。但因长期以来受限于无法规模化保持其后代雄性不育性而不能产业化利用。

3、目前对于核雄性不育系的利用基本原理是将育性恢复基因元件、雄配子败育元件/致死元件及种子色选元件集成至一个载体中，转入核雄性不育系中，创制核雄性不育系的保持系，由于雄配子败育元件/致死元件的特殊功能，使得核雄性不育保持系的转基因花粉(含有雄配子败育元件/致死元件的花粉)败育或死亡，故无法将转基因花粉传出。因此在转育核雄性不育保持系元件或载体过程中只能作为母本，接受其他品种的花粉，而不能作为父本将核雄性不育保持系元件或载体授粉出去，限制了核雄性不育保持系的转育自由，也导致核雄性不育保持系和不育系的细胞质的单一化。

4、orf79基因是现有技术在bt型细胞质雄性不育水稻中发现的一种能够编码细胞毒素的基因，其被证实为水稻配子体细胞质雄性不育基因，其在水稻中表达导致花粉呈雄配子体雄性不育。

技术实现思路

1、为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种含orf79的核雄性不育保持系的转育系统及其应用，通过沉默核雄性不育保持系中的雄配子败育元件使其可以作为父本授予花粉给其他植株，从而得到提高保持系后代的细胞质多样性。

2、现有育种过程中所使用的核雄性不育保持系材料含有两种类型的花粉，其中一种花粉由于含有遗传转化载体，也就是雄配子败育元件/致死元件，这种花粉最终会死亡，无法成熟；另一种不含遗传转化载体，是非转基因花粉，会正常生长。因此，最终形成的成熟花粉只有一种，即不含遗传转化载体的非转基因花粉。故在转育核雄性不育保持系元件或载体过程中只能作为母本，接受其他品种的花粉，而不能作为父本将核雄性不育保持系元件或载体授粉出去，限制了核雄性不育保持系的转育自由。

3、如果核雄性不育保持系只能作为母本与其它育种材料杂交，则所选育的保持系均具有相同的细胞质(线粒体和叶绿体)基因组，会在保持系中形成细胞质遗传单一化的局面。然而，细胞质遗传多样性对植物的性状具有重要影响。细胞质效应广泛影响作物的产量、株高、叶宽、蛋白含量、花期、籽粒油含量等性状。杂交作物细胞质单一化既存在诱发病害爆发的风险，也限制了农作物品种长期选育效果。

4、基于此，本发明体用了一种方法，沉默核雄性不育保持系中的雄配子败育元件使其可以作为父本授予花粉给其他植株

5、第一方面，本发明提供一种核雄性不育保持系的转育系统，包括：雄配子败育元件的基因沉默元件；所述雄配子败育元件为orf79基因。

6、进一步地，还包括：

7、沉默标记报告元件和筛选标记元件；

8、所述沉默标记报告元件与核雄性不育保持系中的色选标记基因不同，所述沉默标记报告元件用于区分不同功能的种子；

9、所述沉默标记报告元件优选包括：gus、gfp、yfp、bfp、cfp或rfp中的一种或多种。

10、本发明所提供的转育系统，针对核雄性不育保持系中的orf79基因序列，设计其基因沉默元件，用于抑制该基因的功能，使含有orf79基因的花粉不完全败育或死亡，从而使核雄性不育保持系可以产生携带转基因(核雄性不育保持系元件或载体)的花粉，并作为父本传粉至其他材料，从而实现置换核雄性不育保持系和不育系细胞质的目的。在gati系统中与orf79基因的沉默元件连锁的沉默标记报告元件，作为沉默元件的报告基因，用于显示和分选含有沉默元件的种子或植株；筛选标记元件，用于遗传转化筛选和区分及gati种子或植株。

11、进一步地，所述基因沉默元件通过如下任意一种或多种方法抑制所述雄配子败育元件的功能：

12、i)抑制所述雄配子败育元件的转录，包括利用rnai、amirna、sirna、asrna或crispri、启动子竞争性结合；

13、ii)抑制所述雄配子败育元件所翻译出的蛋白；

14、iii)通过与所述雄配子败育元件表达盒的产物结合、化学修饰、或特异性降解而抑制该产物的生化功能。

15、本发明所提供的转育系统中，沉默标记报告元件及筛选标记元件的设计，以及可选择的基因沉默技术均已在中国专利(申请号：202210323819.6)中记载，中国专利(申请号：202210323819.6)所记载的内容均作为本发明的内容。

16、进一步地，所述基因沉默元件由启动子-茎环结构-终止子，或由启动子-反义编码序列-终止子，或由启动子-dcas9-终止子、雄配子败育元件的靶标结合序列构成。

17、进一步地，所述基因沉默元件包括如seq id no.1-3所示的核苷酸序列。

18、本发明提供的转育系统，针对利用orf79基因作为雄配子败育元件/致死元件的核雄性不育保持系统，本发明提供的转育系统，包括但不限于在gat技术中应用。(gat技术的具体信息，见申请号为202010378962.6、202010379287.9、202010378963.0、2021113336788的中国专利)。

19、以下利用gat核雄性不育保持系作替代说明，但本发明并不仅适用于gat代表的核雄性不育保持系统，还可用于其他类型的核雄性不育系统，本发明提供的转育系统，含有orf79基因的基因沉默元件、沉默标记报告元件和筛选标记元件的载体、植株或种子材料简称为gati载体、gati植株或gati种子材料。

20、第二方面，本发明提供一种核雄性不育保持系的转育方法，包括：将所述的转育系统导入材料a中，获得第一植株；

21、将所述第一植株作为父本，核雄性不育保持系材料b作为母本杂交得到第二植株；所述第二植株包括f1代及f1代自交或杂交后代中仍含有核雄性不育保持系位点和转育系统位点的材料；

22、将所述第二植株作为父本授粉至其他植物材料中，获得与核雄性不育保持系材料b细胞质不同的核雄性不育保持系。

23、进一步地，以第二植株代作为父本授粉至其他植物材料，其后代中，既有沉默元件标记(gati)和核雄性不育保持系标记的，可用于后续继续转育；

24、其后代中，仅有核雄性不育保持系标记的，可用于核雄性不育系或保持系的品种选育或种子生产；

25、其后代中，仅有沉默元件标记(gati)可用于和相应核雄性不育保持系杂交。

26、本发明提供的转育方法增加了核雄性不育保持系的转育自由度，同时可将核雄性不育保持系元件转移至新细胞质种质资源的材料中，实现细胞质的更换。

27、本发明进一步提供所述的转育系统在提高核雄性不育保持系细胞质遗传多样性中的应用。

28、第三方面，本发明提供一种提高核雄性不育保持系细胞质遗传多样性的方法，包括：以第一植株作为父本与初始核雄性不育保持系材料进行杂交，获得第二植株，所述第二植株的种子经自交、回交或与其他材料杂交，获得目标植株；

29、所述第一植株携带转育系统位点i；

30、所述转育系统位点i包括：抑制核雄性不育保持系位点g中orf79基因的基因沉默表达盒，转育系统位点i的标记报告元件表达盒，转育系统位点i的筛选标记元件表达盒；

31、所述核雄性不育保持系位点g包括雄性不育恢复元件表达盒、orf79基因表达盒和保持系的筛选标记表达盒。

32、进一步地，所述第一植株的基因型为，纯合ii或杂合i-；优选地，所述第一植株的基因型为ii；

33、所述第二植株基因型为，纯合gg/ii或杂合g-/i-或半杂合gg/i-、g-/ii，所述第二植株可以携带核雄性不育基因ms，优选地，所述第二植株的基因型为msms/gg/ii或msms/g-/ii。

34、在本发明提供的方法中，所述目标植株为选育得到的新的核雄性不育保持系，所述目标植株的细胞质与初始核雄性不育保持系的细胞质不同；优选地，由第二植株作为父本，母本选择与初始核雄性不育保持系细胞质不同的核雄性不育保持系，不育系或其他材料杂交，经自交回交获得中间材料并最终获得新的核雄性不育保持系，即所述目标植株。

35、第四方面，本发明提供一种植物表达载体gati，含有由seq id no.1-3所示的dna片段所形成的发卡结构或其核苷酸序列如seq id no.4或5或12所示，所述植物表达载体gati用于抑制所述方法中核雄性不育保持系位点g中的orf79基因的功能。

36、本发明提供的gati植物表达载体，含有发卡结构表达盒，其中所述发卡结构表达盒含有由seq id no.1-3所示的dna片段所形成的发卡结构。

37、其中，seq id no.1所示的dna片段为基于细胞质雄性不育基因orf79编码框的长度为169bp的正向dna片段，seq id no.3所示的dna片段为基于细胞质雄性不育基因orf79基因编码框的长度为169bp的与seq id no.1所示的dna片段反向互补的dna片段。seq idno.2为来自水稻zinc finger基因的内含子序列(rice intron)。

38、seq id no.1至3所示的dna片段按照从上游到下游的方向依次排列。该发夹表达盒可在转化的植物细胞中转录形成发卡式的二级结构，seq id no.2所示的dna片段形成发卡的“环”，seq id no.1和3所示的dna片段互补形成发卡的“茎”。

39、其中，所述发卡结构表达盒还包括位于发卡结构上游的植物组成型启动子或植物组织特异性启动子，以及，位于发卡结构下游的终止子。

40、针对本发明提供的gati材料，进行表型鉴定的方法，已记载在中国专利(申请号：202210323819.6)中。本发明提供的gati载体的选择标记表达盒的设计思路与中国专利(申请号：202210323819.6)中相同。

41、除表型鉴定筛选外，还可用相应的核雄性不育保持系及gati各自的分子标记进行筛选区分。上述杂交种自交或再次授粉给其他材料产生的后代中若通过基因组pcr检测，后代中仅含核雄性不育保持系分子标记的为新核雄性不育保持系材料；后代中仅含gati分子标记的为gati材料；后代中两者都有的为含gati和核雄性不育保持系的材料，可继续用于自交繁殖或作为父本实现核雄性不育保持系杂交转育。

42、根据本领域技术人员的理解，本发明还请求保护上述的转育方法在制备植物核雄性不育保持系中的应用。

43、在上述应用中，所述植物为水稻、玉米、棉花、油菜或大豆、小麦等杂交作物；

44、优选地，所述植物为水稻或玉米。

45、在本发明的一种实施方式中，获得gati材料的方法包括：

46、(1)构建植物表达载体：将seq id no.1-3所示的dna片段用overlapping方法连接到植物双元转化载体ptck303的saci和bamhi位点间，得到植物表达载体gati-orf79i；

47、(2)转化：将gati-orf79i通过通过农杆菌介导遗传转化法、基因枪法、花粉管通道法等常规生物学方法转化植物细胞或组织，获得gati转基因植株。

48、其中，所述植物表达载体gati-orf79i分别具有seq id no.4所示的核苷酸序列。

49、同时用荧光蛋白表达盒替换ptck303载体中的gus表达盒，优选使用gfp表达盒，所获得的gati载体命名为gati-orf79i-gfp其序列如seq id no.18，获得相应的转基因材料。

50、本发明还提供了一种gati植物表达载体在核雄性不育保持系材料转育过程的应用方法。

51、本发明所述的方法为使用gati材料与核雄性不育保持系材料杂交，所获f1种子在花期可使得含核雄性不育保持系元件的转基因花粉不全部被降解或杀死，从而部分或全部具有活性，因此可授粉至其他材料。

52、本发明具备如下有益效果：

53、(1)本发明提供的核雄性不育保持系的转育系统及其转育方法，可用于多种植物，特别是农作物的核雄性不育保持系转育；同时解决了核不育保持系转育不自由问题，使之既可以做母本，也可以做父本进行核雄性不育保持系载体的杂交转育。

54、(2)本发明通过各种元件的协同作用，准确筛选出杂交或自交后代中的表型，后代中仅含核雄性不育保持系位点相应抗生素或除草剂抗性或特定种子荧光如红色荧光种子的，为新的核雄性不育保持系材料；后代中仅含潮霉素抗性的或特定种子荧光如绿色种子荧光的，或可用特定染色的标记如gus标记的为gati材料；后代中两者都有的为含gati和核雄性不育保持系位点的材料，可继续用于自交繁殖或作为父本实现核雄性不育保持系杂交转育。

55、(3)本发明提供的提高核雄性不育保持系细胞质遗传多样性的方法，首次通过传统杂交实现了保持系细胞质遗传物质的更换，并且显著提升了核雄性不育保持系的细胞质遗传多样性，避免了细胞质单一化对长期育种和生产带来的危害，对农作物杂交种的长期选育具有重要意义。