一种慢病毒包装滴度试剂盒的制作方法

本发明涉及病毒包装领域，具体涉及一种慢病毒包装滴度试剂盒。

背景技术：

1、随着当今医学技术的不断革新，分子生物学、生物化学等学科的发展和基因序列的不断深入研究，基因治疗技术在上世纪末应运而生；该技术通过纠正或补偿基因缺陷和异常表达来达到治疗疾病的目的，已成为治疗先天遗传性、免疫性、某些感染性、血液性疾病以及肿瘤的新焦点。其中，慢病毒载体(lentivirus vector，lv)因其转染效率高，可感染分裂期和非分裂期细胞，可容纳较大的基因片段等优点，在基因治疗领域有着广泛的应用前景。

2、慢病毒属(lentivirus)在分类上属于逆转录病毒科，为二倍体rna病毒。其基因结构包括gag、pol、env、vif、vpr、nef、vpu和2个调节基因tat和rev等。其中，gag负责编码合成衣壳蛋白(p24)、内膜蛋白(p17)以及核衣壳蛋白(p7)等关键蛋白，pol负责编码病毒复制相关酶，env负责编码病毒包膜糖蛋白。rev参与调节蛋白的表达，tat与病毒的长末端重复序列(long terminal repeats，ltrs)结合后促进病毒的所有基因的转录。vif、vpr、vpu、nef为辅助基因，将辅助基因编码的蛋白当做毒力因子，可用来主导宿主细胞的感染以及识别。

3、而慢病毒载体则是以慢病毒的基因组为基础，将其中多个和病毒活性相关的序列结构去除，使其具有生物学的安全性，然后，再在这个基因组骨架中引入实验所需要的目标基因的序列和表达结构，并将之制备成载体。慢病毒载体由最初的hiv-1型载体系统经过不断优化发展至今已更新到第四代质粒系统，为四质粒系统，也是目前使用最广泛的慢病毒载体系统。

4、第一个质粒发挥组装功能，编码形成病毒颗粒所必需的蛋白，全部pol以及gag序列包括在此质粒内，且去掉了4个辅助基因。第二个质粒含具整合、逆转录以及组装功能的反式作用序列因子，此质粒为病毒载体最为关键的部分，包括rre、ltr。第三个质粒负责编码翻译合成vsv的糖蛋白g。第四个质粒含曾经包含在组装质粒内的rev序列。在慢病毒的制备中，把四个质粒一同转染到细胞中，使其增殖，最终获得表达质粒。

5、然而慢病毒载体也存在一定的局限性—病毒滴度低，这使得基因治疗成本变得十分昂贵，与基因疾病患者对基因药物的需求存在巨大的矛盾。因此，构建更加高效的慢病毒载体以提高慢病毒滴度从而加速基于慢病毒载体的基因药物的发展显得尤为重要。

6、由于慢病毒载体主要来源为hiv病毒，其生物安全性成为使用者担心的主要问题之一，为阻止慢病毒载体整合进宿主基因组形成有复制能力的hiv病毒，其分子结构被不断改进，慢病毒载体中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒，同时为降低病毒基因重组几率，目前人们广泛使用四质粒系统来包装滴度，但这也直接导致了病毒包装效率低下的问题。因此亟需从各个方面对慢病毒包装载体进行优化，从而得到一种可用于提高慢病毒包装滴度的试剂盒，使得慢病毒基因广泛应用于研究和临床。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种慢病毒包装滴度试剂盒。

2、本发明提供了载体组合，其包括辅助质粒a，辅助质粒b。

3、本发明中，所述辅助质粒a由质粒a’改造而来，质粒a’的结构元件包括cmv启动子、hiv-1gag、rre、hiv-1pol、ampr、ori、hbb 3’utr,其表达组成病毒中心和结构的蛋白质gag和转录酶。改造后的辅助质粒a的结构元件包括cag启动子、hiv-1gag、rre、hiv-1pol、kanr、puc ori、rbg pa；其中，所述cag启动子序列如seq id no:3所示；所述rbg pa核酸如seq idno:4所示。

4、本发明中，所述辅助质粒b由质粒b’改造而来，质粒b’的结构元件包括rev、hiv-ltr、ampr、f1 ori、ori、rsv启动子。改造后的辅助质粒b的结构元件包括rev、hbg pa、kanr、puc ori、rsv；其中，所述hbg pa核酸如seq id no:5所示。

5、本发明中，所述辅助质粒a的核苷酸序列如seq id no:1所示；所述辅助质粒b的核苷酸序列如seq id no:2所示。

6、进一步的，本发明所述的载体组合还包括辅助质粒c和表达质粒。

7、本发明中，所述辅助质粒c含有vsv-g衣壳编码基因。本发明所述辅助质粒c选自pmd.g、pmd2.g、pvsv-g、vsv.g、pcag-vsvg、phdm-vsv-g、pcef-vsv-g、pci-vsvg、prp[exp]-cmv>vsvg、pcmv-vsv-g、plp/vsvg或pvpack-vsv-g中的至少一种。本发明以载体prp[exp]-cmv>vsvg为辅助质粒，用于本发明所述的病毒包装试剂盒的构建。

8、本发明中，所述的表达质粒包括目的基因，本发明实施例中，所述以荧光蛋白egfp编码基因为例对效果进行验证，实际使用中，可根据需求将egfp替换为待研究的其它目的基因；本发明所述的表达质粒为慢病毒载体，具体的，可以选自第二代或第三代慢病毒表达载体，如plv或plvx系列载体、plko系列载体、psmpuw或plenti系列等hiv表达载体中的至少一种。本发明以plv载体plv[exp]-cmv>egfp为表达载体用于本发明所述的病毒包装试剂盒的构建。

9、本发明所述的载体组合中，所述辅助质粒a、辅助质粒b、慢病毒包装辅助质粒c、表达质粒的质量比为(1～9)：(1～9)：4：10。

10、本发明针对常规病毒辅助质粒进行了改造，改造在保留慢病毒包装所必须的必要元件的基础上对复制起始位点、启动子、终止子、增强子等组合原件进行了优化，构建了高效病毒包装载体组合。实验结果表明，本发明所述辅助质粒a、辅助质粒b、辅助质粒c、表达质粒的质量比为7：7：4：10时病毒包装滴度显著提高，显著高于未改造的载体组合，载体改造效果明显。

11、本发明中，所述的载体组合中的各个质粒协调互助用于高滴度病毒载体组合及试剂盒的构建。

12、本发明所述载体组合或载体，是指核酸载体，是一种重组dna分子，其包含期望的编码序列和对可操作连接的编码基因在具体宿主生物内的表达所必不可少的合适的核酸序列或元件。对模式动物或哺乳动物细胞中的表达必需的核酸序列或元件包括启动子，核糖体结合位点及可能的其它序列。已知真核细胞利用启动子，增强子以及终止子。一经转化进入合适的宿主，载体可以独立于宿主基因组进行复制和发挥作用，或者，在一些情况下，自己整合进入基因组。在本说明书中，“质粒”和“载体”有时可以交换通用，因为质粒是当前最普遍使用的载体形式。然而，本发明意图包括表达载体的这样的其它形式，其发挥等价作用，其在本领域是已知的或将变为已知的，包括但不限于：质粒，噬菌体颗粒，病毒载体和/或仅为潜在的基因组插入物。

13、本发明提供了所述的载体组合在制备病毒包装试剂中的应用。

14、本发明中，所述的病毒包括腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、阮病毒，本发明对此不作限定。本发明中，所述的载体组合主要用于慢病毒的包装。

15、本发明中，所述的病毒包装试剂包括所述的载体组合中的单个或多个质粒与本领域常用的试剂混合后制成的病毒包装试剂，本发明对此不做限定。进一步的，所述的病毒包装试剂的剂型包括液剂、粉剂、乳剂、油剂等。

16、本发明提供了宿主，其包含本发明所述的载体组合。

17、本发明中，所述的宿主包括大肠杆菌，其可作为载体构建、扩繁或保存的工厂。

18、本发明提供了慢病毒包装试剂盒，其包括本发明所述的载体组合和转染试剂。

19、本发明中，所述的慢病毒包装试剂盒中的转染试剂包括磷酸钙、脂质体、脂质体纳米微粒、聚合物或多肽、病毒感染增强剂等。所述的脂质体包括阳离子脂质体，所述的阳离子脂质体包括dota、dotma、dospa、dogs或dc-chol。所述的聚合物转染试剂包括聚-β-氨基脂、聚乳酸-乙醇酸共聚物或聚乙烯亚胺。

20、进一步的，本发明所述的转染试剂，还包括针对不同细胞系的转染试剂，其包括a204细胞系转染试剂、a549细胞系转染试剂、asmc转染试剂、caki-1细胞系转染试剂、cfpeo细胞系转染试剂、cho细胞系转染试剂、嗜铬细胞系转染试剂、d-407细胞系转染试剂、di-tnc1细胞系转染试剂、fadu细胞系转染试剂、成纤维细胞系转染试剂、hcaec细胞系转染试剂、hcn-1a细胞系转染试剂、hcs-2细胞系转染试剂、hek-293细胞系转染试剂、hela细胞系转染试剂、ht-29细胞系转染试剂、huh-7细胞系转染试剂、角质形成细胞系转染试剂、lncap细胞系转染试剂、mef细胞系转染试剂、mrc-5细胞系转染试剂、nih3t3细胞系转染试剂、panc1细胞系转染试剂、pc-3细胞系转染试剂、pgham细胞系转染试剂、u87细胞系转染试剂、vero细胞系转染试剂、sk-n-mc细胞系转染试剂、sknas细胞系转染试剂、weri-rb-1细胞系转染试剂、pc-12细胞系转染试剂、3ll细胞系转染试剂或aspc-1细胞系转染试剂，本发明对此不做限定。

21、在一些具体实施例中，本发明利用磷酸钙将所述载体组合转化受体细胞，用于病毒包装效果的鉴定。进一步的，所述的受体细胞包括但不限于hek-293、hek293t、hep g2、hela、cho-k1、cos-1、cos-7、nih3t3、a204、a549、d-407、cho、hcs-2、ht-29、u87或sf9。

22、本发明提供了慢病毒的包装方法，其为利用本发明所述的载体组合或本发明所述的包装试剂盒生产慢病毒。

23、本发明对现有病毒包装载体进行了改造，构建了高病毒包装滴度试剂盒。本发明针对常规病毒辅助质粒，在保留慢病毒包装所必须的必要元件的基础上对复制起始位点、启动子、终止子、增强子等组合原件进行了优化，构建了高效病毒包装载体和高滴度病毒包装试剂盒。本发明构建的病毒包装试剂盒，载体转染效率高，病毒包装滴度高，具有广泛的应用前景。