一种基于DNA框架结构的纳米光学编码技术及应用

本技术涉及生物，具体涉及一种基于dna框架结构的纳米光学编码技术及应用。

背景技术：

1、生物编码技术是指采用具有可区分信号的生物编码识别单元，其中每个编码识别探针均与靶标的某种信息相关联，根据生物编码识别单元识别和追踪生物标志物，通过信息解码后，实现对生物信息的还原。通常，生物编码技术主要包括以下要素：1)编码识别单元。主要包括识别探针如核酸、抗体等、编码载体以及编码方法。其中编码载体的尺寸及材料性质、信号报告分子、编码信号产生方式及放大技术是影响编码识别的重要因素。理想的编码识别单元应具备低成本、灵敏、特异、稳定等性能，对于在体成像而言，理想的编码识别探针还要具备较好的生物相容性、较高的细胞内化效率；2)编码信号的解读，即解码。主要指通过物理光电检测技术或仪器对编码识别单元获取的生物信号进行读取。按照解码物理信号输出的方式可分为光学解码仪器、磁性解码仪器等；3)编码库的构建。由多个可区分的生物编码信号形成的数据库。4)生物编码技术的应用。该技术在生物传感领域中应用广泛，如生物检测、细胞成像、动物在体成像等。

2、目前，商业化产品有luminex公司发展的xmap技术、nanostring ncounter分析系统和10×genomics公司开发的单细胞测序编码技术和文献报道中常使用微米级尺寸的编码载体。其中，xmap技术采用微米级尺寸的微球(～6.5μm)作为编码载体，以三种荧光染料作为信号报告分子，实现对上百种蛋白质或核酸的多重检测。10×genomics以微米尺寸的凝胶微球作为编码载体，以dna序列作为信号报告分子，实现对单细胞转录组的高通量测序。

3、虽然上述两种技术具有简单经济、编码容量大的优势，但微米级尺寸编码载体仍带来一些挑战。首先，当使用有机荧光分子作为编码报告分子时，一个重要挑战是在聚合物微球中控制装载比例。对于大多数传统的有机荧光染料来说，高浓度负载浓度下会发生聚集，这些染料的结构使得染料分子之间以π-π堆积的方式排列，导致聚集引起的淬灭(aggregation-caused quenching,acq)，结果是荧光强度大大减弱，降低了编码识别单元的灵敏性。第二，在微米级尺寸的编码载体制备过程中通常会出现识别探针泄露的情况。如：通过层层组装的方法(layer by layer，lbl)制备qds识别探针时，通常会出现qds泄露的问题，导致编码识别单元的稳定性降低。第三，当使用微米级编码载体时，无法精确控制附着在微球表面的生物分子数量、方向和位置，同样影响了编码识别探针的稳定性。例如，古宏晨课题组使用微米级粒子构建主客体结构，形成编码识别探针。将多种粒子包裹在单个微球中的策略可能会提高编码容量，但代价是降低了粒子内化效率。由于细胞很难通过内吞作用内化较大尺寸的粒子，即使在使用能够促进细胞内化的转染试剂如肽或蛋白质情况下，粒子仍然会被截留在核仁和脂质体中，而不是分布在整个细胞质中。因此，基于微米尺寸的编码载体发展的生物编码技术存在一定的局限性，尤其是在多重检测分析以及在体成像领域。

4、四面体dna结构(tetrahedron dna nanostructure，简称tdn)是由4条ssdna组成，通过巧妙的dna序列设计，利用碱基互补配对原则，每条ssdna分别与其他三条ssdna片段杂交结合形成四面体结构的一个面，每条ssdna的5’端和3’端交汇于四面体顶点处。tdn具有以下优势：1)小尺寸的纳米识别探针能够识别细胞内较小尺寸的靶标分子，使其更有利于在体成像，弥补了微米级尺寸编码载体带来的细胞内化问题；2)dna具有良好的生物相容性；3)特定数量的分子或材料易于在特定位置实现功能化修饰；目前，已有关于利用“树枝”状dna结构作为编码载体构建编码识别探针的报道。在该编码方法中，使用该dna结构作为编码载体不仅能够精确控制荧光分子的数量和位置，而且dna作为核酸类材料在生物分析中并不具有潜在毒性。适用于在体检测/成像。但该编码策略存在的缺点是若在该结构上通过连接数量较多的荧光分子以提高编码容量，则可能需要更多dna“分支”或更长的dna链与之相匹配，这样不仅造成空间浪费，而且体积过大不利于后期实际应用。

5、有机荧光染料是最常见的信号报告分子，被广泛用于生物检测、活体成像等领域，例如xmap技术。但由于大多数有机染料具有光谱重叠、拖尾、光谱峰较宽等缺陷，很容易产生荧光共振能量转移(resonance energy transfer，fret)效应。通常，构建基于有机荧光染料编码识别探针需要解决的一个重要问题是：如何避免能量转移现象的发生。一般策略是将一种颜色(波长)的荧光材料作为一种编码信号，比如2种不同颜色的荧光材料只能产生3种可区分的光学信号，且控制荧光分子之间的距离大于r0(能量转移半径)。fret是依赖于供体和受体分子间距的光物理进程，处于激发态的荧光团通过偶极子间的相互作用将能量以非辐射的方式转移给临近的受体分子，从而导致供体荧光降低和受体荧光发射的增加。如果利用不同荧光分子之间的fret效应产生可区分光学信号作为编码策略，那么利用有限种类的荧光材料可以产生更多可区分的光学信号。因此，fret编码策略有望弥补上述传统光学编码方法的缺陷。此外，相较于常见的单通道荧光信号，fret效应能够产生较大的stokes位移，它可以通过减少光散射、增加组织信号深度和消除自体荧光，从而有利于在复杂生物系统中荧光成像方面的应用。

6、目前，已报道使用球形纳米材料作为fret编码载体，如谭蔚泓课题组以二氧化硅纳米粒子作为编码载体，使用fitc、r6g和rox荧光分子，实现了单波长激发的多色编码。虽然证明fret效应可用于光学编码，但二氧化硅载体无法精确控制荧光材料在其中的数量、位置，影响了编码识别探针的信号稳定性。tdn作为核酸类材料，能够在任意特定位置实现精确的功能化修饰，若将tdn作为fret编码载体，那么有望解决球形编码载体存在的问题，并通过精确控制荧光分子的数量及其在tdn载体中的位置，极大提高fret编码信号的稳定性，并能根据发射光谱的不同荧光强度水平构建光学条形码库，作为编码探针可以应用于同时检测体外不同mirna分子。

技术实现思路

1、鉴于以上所述现有技术的缺点，本技术的目的在于提供一种基于dna框架结构的纳米光学编码技术及应用，用于解决现有技术中的问题。

2、为实现上述目的及其他相关目的，本技术第一方面提供一种基于dna框架结构的纳米编码探针，所述纳米编码探针包括由四条dna单链组装形成的dna四面体构型，所述dna四面体构型的至少一个顶点设有延伸序列，所述延伸序列包含靶标识别序列，所述dna四面体构型的至少一个顶点组装有荧光分子，所述纳米编码探针以其dna四面体构型顶点组装的荧光分子的种类和/或数量作为编码信息。

3、本技术第二方面提供一种纳米编码探针检测系统，包括所述的纳米编码探针，磁珠以及捕获链，所述磁珠与捕获链适于反应性结合以形成磁珠-捕获链复合物。

4、本技术第三方面提供一种适于同时检测多种靶标分子的探针组合，至少包括两种以上的所述的纳米编码探针，不同靶标分子对应不同的纳米编码探针，不同的纳米编码探针之间的编码信息和靶标识别序列均不同。

5、本技术第四方面提供一种适于同时检测多种靶标分子的探针检测系统，包含所述的探针组合，所述的磁珠以及两种以上捕获链，不同靶标分子对应不同的捕获链，所述磁珠与捕获链适于反应性结合以形成磁珠-捕获链复合物。

6、本技术第五方面提供所述的纳米编码探针，或所述的纳米编码探针检测系统，或所述的探针组合，或所述的探针检测系统在制备体外检测产品中的用途。

7、与现有技术相比，本技术的有益效果为：

8、1、通过在dna四面体构型上组装不同的荧光分子作为编码信息，获得至少26种编码策略，能够精确控制荧光分子的数量及其在载体中的位置，提高编码信号的稳定性。

9、2、通过构建纳米编码探针检测系统，利用磁珠与捕获链形成复合物，捕获链与靶标分子的一部分互补，靶标识别序列与靶标分子的另一部分互补，能形成包括磁珠、捕获链、靶标分子及纳米编码探针的复合体，并通过分析荧光强度，可以同时检测体外不同mirna分子，实现体外靶标分子的高特异性、高灵敏度的定量检测。

10、3、相较于二维结构，dna三维结构能够在有限空间内实现编码。

11、4、相较于含有多个tdns的编码系统，该编码策略构建的编码探针具有较好的细胞内化性能，更适用于细胞成像等领域的研究。

12、5、相较于无机材料制备的编码载体，dna不存在潜在的毒性问题。