一种基于切口酶错配活性的核酸等温扩增检测体系的制作方法

本发明属于基因检测领域，具体涉及利用切口酶具有错配切割能力的特性设计和开发出特异性探针及其扩增检测应用。

背景技术：

1、核酸检测已广泛地应用于传染病或遗传病诊断、流行病学调查、肿瘤突变基因检测等领域，与免疫学检测技术相比，分子诊断灵敏度更高,结果更准确、可靠。核酸检测的最关键步骤为核酸扩增技术，聚合酶链式反应(pcr)是一种经典成熟的体外核酸扩增方法，因此，荧光定量pcr检测技术成为最为重要的疫情防控检测手段。然而，大型精密仪器及复杂的操作步骤，使得其应用场景依然受限。近些年来恒温体外核酸扩增技术悄然兴起，如lamp(环介导等温扩增技术)、tma(转录介导的扩增方法)、rpa(重组酶聚合酶扩增)、sda(链置换扩增技术)、hda(解旋酶依赖型扩增技术)、nasba(依赖核酸序列的扩增技术)、rca(滚环复制核酸扩增技术)、near(切口酶扩增反应技术)等。而采用恒温扩增技术方法的poct产品凭借其操作简单、检测时间少、携带方便及成本低的优点，可能会成为未来体外诊断行业发展的重要分支。

2、链置换扩增技术(strand displacement amplification,sda)是一种等温体外核酸扩增技术，最早设计是由g t walker等人(1992)基于hinc ii切开其识别位点的半磷硫代形式未修饰链的能力，以及外切酶缺陷klenow延伸缺口处3'端并取代下游dna链的能力进行扩增延伸反应，扩增产物通过双向延伸实现指数级增长扩增。

3、随着单链缺口限制性内切酶(又称切口酶)的发现，人们逐步用其替代双链限制性内切酶和修饰的单核苷酸方法。2000，new england biolabs,inc.科学团队建立了以nt.bstnbi 缺口酶和bst dna polymerase为基础的扩增反应，并分别证明了其它缺口酶如nt.alw i或 n.mly i等同样可以应用于双链扩增(wo01/94544a2)。van ness j.等2003以dna聚合酶和缺口酶为扩增体系的expar(exponential amplification reaction)检测试验，扩增速度极为迅速，可以在5分钟之内完成106以上的扩增倍数。然而，其团队成员erictan等(2008 年)发现，扩增中无法排除非特异扩增或假阳性现象，并通过拆分buffer和酶的成分、加热后混合等措施，控制和降低非特异性扩增程度。traci kiesling等2007利用nt.alw i和 nt.bstnbi与dna聚合酶进行扩增检测反应，并将其命名为nesa扩增技术。jianwei jeffery li等2008年也采用n.bbvc ia,n.bbvc ib and n.bstnbi进行了类似扩增检测。

4、在上世纪60年代，kornberg便提出dna聚合酶具有不依赖于引物或模板的dna合成能力的可能性。随着研究的不断深入，dna聚合酶这种能力被证实，称之为ab initio，起始合成(1997,1998，ogata等)。而2006年，xingguo liang等发现，当限制性内切酶或切口酶同时存在时极大促进这种非模板或引物依赖型合成作用。随后，xingguo liang研究团队、俄罗斯研究团队nadezhda v.zyrina等分别研究了起始合成的扩增模型，证实切口酶或限制性内切酶存在下，dna聚合酶可以合成短的缺口酶或限制性内切酶识别序列或相近的重复串联片段，继而这些片段被迅速扩增延伸，形成大量的非特异的ab initio扩增产物，成为了限制利用这类酶进行核酸扩增的重要因素之一。

5、美国雅培公司的id now技术基于切口酶恒温扩增反应技术，利用荧光标记的分子信标用于特异性检测扩增的靶标，利用此技术分别开发了a族链球菌、流感病毒、呼吸道合胞病毒等检测。也开发了基于切口酶恒温扩增反应技术和id now分子诊断平台的解决方案。虽然id now分子诊断平台技术可以进行非常快速的检测，在几分钟之内便得出结果。然而新冠检测产品上市以来，大量的研究者在实际测试时发现其灵敏度较低，比如run jin等研究人员1794个回顾性阳性样本以及224前瞻性阳性分析中id now阳性符合率大约只有83％。harrington等研究人员分析了524个样本中，与qpcr 对比，阳性符合率大约75％，阴性符合率约99％。zhen等人通过不同方式的比较，得出了id now针对实际样本最低检测限大约20000copies/ml。在这些数据表明此类技术在临床应用中存在较大缺陷。

6、因此，如何通过切口酶恒温扩增技术，实现高灵敏度的核酸检测，是目前亟待攻克的难题。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提供了一种基于切口酶错配活性的核酸等温扩增检测体系，利用切口酶在切割识别序列的互补链上的碱基序列发生改变的情况下，仍不影响切口酶的切割活性的特性，设计出带有切口酶切割识别序列的引物探针组，并使靶核酸上含有能与切口酶切割识别序列错配的互补链，在等温扩增过程中，通过切口酶对探针进行切割，实现一个模板链不断结合探针并不断被切割释放荧光信号的循环过程，大幅提高待测靶核酸的荧光强度，提高检测灵敏度。

2、一方面，本发明提供了一种探针，所述探针能与扩增产物结合，所述探针中含有切口酶的切割识别序列；所述扩增产物中含有能与切口酶切割识别序列错配的互补链。

3、每种切口酶具有其特定的切割识别序列，当含有该切割识别序列的单链与互补链结合成双链后，切口酶能对含有切割识别序列的单链进行切割(也就是说必须形成双链后，才会对其中含有识别序列的单链进行切割)，切割位点在切割识别序列附近。不同切口酶的识别序列和切割位置可能会有不同，比如nt.bstnbi，能在距离识别序列3’端4个核苷酸的位置切割含有识别序列的单链。

4、现有技术普遍认为，切口酶恒温扩增时，扩增产物中不能有切口酶识别序列，这主要是因为，如果扩增片段具有切口酶识别序列，则扩增片段(与探针相同方向序列的模板)也会被切割后，形成与探针序列相同的扩增产物，从而与探针竞争性与反向互补链结合，而该扩增产物若与互补链结合后，并不能释放待测标志物(如荧光信号)，导致该互补链无法被检测到，从而严重影响核酸检测结果。如专利us2018/0023118中就明确说明扩增产物中不能有切口酶识别序列，探针的设计是需要与扩增产物中的一条单链互补，因此现有的探针、扩增产物中同样都不能有切口酶识别序列。

5、切口酶具有错配切割特性：酶切割位点所在识别序列上的碱基，在于互补链上的碱基进行互补结合时，互补链中的碱基并不能与切口酶识别序列上的碱基完全互补，也就是说互补链中至少存在一个碱基不能与切口酶识别序列互补，但互补链仍然与切口酶识别序列结合成了双链，此时就是发生了错配，在发生一个或多个碱基错配时，切口酶仍能对该切割位点进行切割，这就是切口酶的错配切割特性，也称为切口酶的星号活性。

6、本发明基于切口酶的错配切割活性，找到了一种全新的探针设计方式：首先对待测靶序列进行研究，待测靶核酸的序列非常长，通常能够找到其中带有与切割识别序列的互补链非常接近，但其中有个别碱基不能完全互补的序列，从而以该序列作为待测靶序列，采用该靶核酸进行扩增，扩增产物中也必然会存在同样的个别碱基不能与切口酶切割识别序列完全互补的序列；同时设计带有切割识别序列的探针。由于探针的序列中除了切割识别序列，还含有其他能与扩增产物单链结合的序列，因此即使扩增产物中有一个碱基与探针序列不匹配时，探针仍然能与单链模板链结合，即发生错配。此时由于探针中含有切割识别序列，即使经错配与互补链结合成双链，仍然能够被切口酶识别并切割，而扩增产物含有的序列与切割识别序列不完全一致，无法被切口酶识别，也无法被切割，从而避免了扩增产物或靶序列被切割而影响核酸检测结果的情况发生。荧光探针上含有切口酶酶切位点 (包括单链识别序列及切割位置)，则当荧光探针与模板序列结合成双链时，切口酶均能对探针进行切割，切割后探针从模板上“脱落”下来，这个时候仍然具有释放荧光，此时另外的探针又可以结合到模板上(探针在反应中是过量的)，因此一条板链可能结合多个探针并且探针会被切口酶切割释放出荧光信号，如此循环反复，使每一条模板链能够产生更强的荧光响应。

7、本发明所述的能与切口酶的切割识别序列错配的互补链，是指能与切割识别序列结合的互补链中，有至少一个碱基不能与切割识别序列的碱基完全配合，因此该互补链只能通过错配实现与切割识别序列结合。

8、现有的切口酶恒温扩增中，一个模板链只能结合一个荧光探针，荧光信号较低，特别是在扩增初期，很难快速的获得检测结果。特别是当采用分子信标探针时，根据分子信标荧光探针的发光机理，分子信标荧光探针在于模板链结合前，为u型发夹结构，分别位于两端的荧光基团与淬灭基团靠近，不能发出荧光，当荧光探针与扩增产物结合，u型发夹结构打开成直链，荧光基团与淬灭基团远离，从而发出荧光，且随着扩增继续进行，扩增产物从单链变成双链的过程中，荧光探针还会脱落，使荧光基团与淬灭基团重新靠近，荧光再次消失，因此现有切口酶恒温扩增的核酸检测灵敏度较低，难以实现准确检测。

9、本发明提供的探针(如荧光探针)进行的切口酶恒温扩增，由于在荧光探针上设置了切口酶识别序列，而扩增产物中不含有切口酶识别序列(仅含有能与切口酶识别序列错配的序列)，不会被切口酶切割。因此一旦荧光探针结合到扩增产物单链中形成双链后，就会被切口酶切割，切割脱落后探针依然发出荧光(探针的荧光基团与淬灭基团彻底分离)，新的荧光探针继续结合到扩增产物单链链中，往而复始，探针不断被切割并释放出荧光信号，使该条模板链的荧光信号得到不断放大，检测灵敏度显著提高。

10、进一步地，所述互补链中至少存在一个碱基不能与切割识别序列互补。

11、在一些方式中，所述切口酶的切割识别序列为“5'-nnnnnnnnnn-3'”，其中n为四种核苷酸碱基中的任意一种，n的数量为任意个核苷酸碱基；所述扩增产物中的能与切口酶切割识别序列错配的互补链为“5'-n'n'n'n'n'n'n'n'n'n-3'”，其中n'为与n在3'到5'方向互补的核苷酸碱基，至少存在一个n'不能与n互补。

12、本发明提供的探针及切口酶恒温扩增系统适合于任何一种切口酶，由于不同切口酶的切割识别序列也不一样，本发明将任意一种切口酶的切割识别序列统一以“5'-nnnnnnnnnn-3'”表示，n为四种核苷酸碱基a、c、t、g中的任意一种，其中的n 的数量根据不同切口酶的识别序列相应改变。

13、能与切口酶切割识别序列错配的互补链，采用“5'-n'n'n'n'n'n'n'n'n'n-3'”表示，其中的n'的数量根据不同切口酶的识别序列相应改变，“5'-nnnnnnnnnn-3'”与“5'-n'n'n'n'n'n'n'n'n'n-3'”互补结合的状态如下：

14、

15、其中，n'中至少存在一个核苷酸碱基不能与n互补，从而造成互补链与切口酶切割识别序列的错配，需要注意的是，只能是互补链中的碱基发生改变导致错配，而不能是切口酶切割识别序列的碱基发生改变，否则切口酶将无法识别切割识别序列，也就无法进行切割。

16、进一步地，所述互补链中的第一个碱基，与切口酶切割识别序列中的最后一个碱基必须互补；所述互补链中的最后一个碱基，与切口酶切割识别序列中的第一个核苷酸碱基不能互补。

17、在一些方式中，所述互补链“5'-n'n'n'n'n'n'n'n'n'n-3'”中的第一个碱基，与切口酶切割识别序列“5'-nnnnnnnnnn-3'”中的最后一个碱基必须互补；所述互补链“5'-n'n'n'n'n'n'n'n'n'n-3'”中的最后一个碱基，与切口酶切割识别序列“5'-nnnnnnnnnn-3'”中的第一个核苷酸碱基不能互补。

18、研究证明，当互补链“5'-n'n'n'n'n'n'n'n'n'n-3'”中的第一个碱基，与切口酶切割识别序列“5'-nnnnnnnnnn-3'”中的最后一个碱基不能互补时，产生的错配情况下，切口酶无法正常切割，因此互补链“5'-n'n'n'n'n'n'n'n'n'n-3'”中的第一个碱基，与切口酶切割识别序列“5'-nnnnnnnnnn-3'”中的最后一个碱基必须互补。而当互补链“5'-nnnnnnnnnn-3'”中的最后一个碱基，与切口酶切割识别序列“5'-nnnnnnnnnn-3'”中的第一个核苷酸碱基不能互补，产生错配时，切口酶依然能够正常切割，具有较好的错配切割性能。本发明正是充分利用了切口酶的这个错配切割活性，在保证切口酶切割识别序列与互补链错配的情况下，使切口酶切割探针，从而显著提高核酸检测灵敏度。

19、进一步地，所述互补链中的最后一个碱基，与切口酶切割识别序列中的第一个核苷酸碱基不能互补，其他碱基都能互补。

20、在一些方式中，所述互补链“5'-n'n'n'n'n'n'n'n'n'n-3'”中的最后一个碱基，与切口酶切割识别序列“5'-nnnnnnnnnn-3'”中的第一个核苷酸碱基不能互补，其他碱基都能互补。

21、切口酶的互补链“5'-n'n'n'n'n'n'n'n'n'n-3'”中的最后一个碱基发生改变，都能与切口酶切割识别序列发生错配，而其他碱基都能正常配对时，切口酶的切割活性不变，从而保证切口酶的错配切割性能。

22、进一步地，所述切口酶为nt.bspqi、nb.bbvci、nb.bsmi、nb.bsrdi、nb.btsi、nt.alwi、nt.bbvci、nt.bstnbi、nt.cvipii、nb.bpul 0l、nt.bpul 0l或n.sbspd61中的任意一种或多种。

23、例如pct/us2004/002718中公开的切口酶都可以被用到本技术中来。

24、进一步地，所述切口酶的切割识别序列为“5'-gagtc-3'”；所述探针中含有“5'-gagtc-3'”；所述扩增产物中含有“5'-gacth-3'”，其中h为碱基t、a或g。

25、在一些方式中，本发明提供的切口酶的切割识别序列为“5'-gagtc-3'”，因此切口酶恒温扩增时，上游引物、下游引物和探针中都必须含有“5'-gagtc-3'”。

26、在扩增产物中，如果直接含有切口酶的切割识别序列，带有切割识别序列的模板dna 链会被不断切割并与探针形成竞争。本发明在模板上不直接引入切割识别序列，而是引入一个或多个碱基突变但仍能与切割识别序列结合的突变互补序列，则不仅该模板dna双链的任何一条都不会被切口酶切割，不会与探针形成竞争。例如使用nt.bstnbi切口酶时，在模板链上引入“5'-gacth-3'”，其中h为碱基t、a或g，则扩增产物不会被切割，同时探针上引入酶切割位点“5'-nnngagtcnnnnn-3'”，其中，n代表任意碱基，则该探针能与扩增产物结合并被nt.bstnbi切口酶切割产生荧光信号。

27、hua wei(2019)通过标记引物对nt.bstnbi结合位点进行了细致的研究，并根据其识别序列gagtc分别在正向链与反向链引入错配后，对于切割活性的影响。研究者绘制了其结合位点处不同位置碱基的重要性(图1)。说明能与识别序列gagtc错配的不同位置碱基，会直接影响nt.bstnbi的切割活性。

28、本发明深入研究了切口酶nt.bstnbi的错配切割活性，找到了能够顺利进行错配切割的碱基序列。与切割识别序列“5'-gagtc-3'”互补的互补链a为“3'-ctcag-5'”，也就是“5'-gactc-3'”。研究证明，当互补链a“5'-gactc-3'”中的第五个碱基发生突变，从c突变为t、a或g时，切口酶依然能对切割识别序列进行顺利切割；而当互补链a “5'-gactc-3'”中的第一个碱基发生突变，从g突变为a、c、t时，切口酶则不能发挥切割作用。

29、因此，待测靶核酸中需要含有“5'-gactc-3'”中的第五个碱基发生突变的序列，即“5'-gacth-3'”，其中h为碱基t、a或g。也就是说，待测靶核酸中需要找到有“5'-gact-3'”，而不能有“5'-gactc-3'”。待测靶核酸通常非常长，含有gact四个碱基的概率基本都是存在的，只要找到合适的靶核酸，就能通过本发明提供的方法进行切口酶恒温扩增，从而进行高灵敏度的核酸检测。

30、在一些方式中，所述切口酶nt.bstnbi的识别和切割位点如下所示：

31、5'-nnnngagtcnnnnn-3'

32、3'-nnnnctcagnnnnn-5'

33、其中，n＝a、c、g或t，切割位点序列为5'-gagtc-3'。

34、在一些方式中，“5'-nnnngagtcnnnnn-3'”中第一个碱基“g”对应的互补碱基“c”突变为“t”、“a”或“g”时，nt.bstnbi仍能识别且切割作用不变，即nt.bstnbi 具有错配切割特性。

35、在一些方式中，并非“5'-gagtc-3'”中的任意碱基发生错配，nt.bstnbi的作用均不会发生变化。所以，在一些方式中，“5'-gagtc-3'”中第五个碱基“c”对应的互补碱基“g”突变为“t”、“a”或“c”时，nt.bstnbi切口酶不能发挥核酸切割作用。这样可以保证nt.bstnbi切割具有一定的特异性。

36、在一些方式中，所述荧光探针包括序列“5'-nnnngagtcnnnnn-3'”，其中，n代表任意碱基。在本技术的一个实施例中，使用含有淬灭基团bhq1、荧光基团fam且含有序列“5'-gagtccagat-3'”的探针通过切口酶核酸扩增检测反应进行新型冠状病毒核酸的检测。

37、进一步地，所述探针类型为taqman探针、mgb探针、分子信标探针中的任意一种；所述探针标记物为荧光素、生物素、地高辛、同位素中的任意一种。

38、本发明适用于任何一种探针，研究证明，通过本发明提供的探针设计方式，都能显著提高核酸的检测灵敏度。

39、进一步地，所述切口酶为nt.bstnbi；所述探针类型为分子信标探针，探针标记物为荧光素，探针的两端分别修饰有荧光基团或淬灭基团。

40、当荧光探针的一端修饰有荧光基团时，另一端修饰有淬灭基团；或者当一端修饰有淬灭基团时，则另一端修饰有荧光基团。

41、在一些方式中，所述荧光基团为fam、tet、vic、hex、tamra、rox、cy5、lcred640 等荧光基团中的一种或多种；所述淬灭基团为dabcyl、bhq1、bhq2、bhq3、mgb等淬灭基团中的一种或多种。

42、在一些方式中，所述探针的核苷酸序列可以含有2'-o-methyl-修饰。

43、另一方面，本发明提供了一种核酸等温扩增检测体系，所述体系包括如上所述的探针。

44、在一些方式中，本发明提供的核酸等温扩增检测体系包括所述引物探针组，所述引物探针组包括正向引物、下游引物和探针，上游引物、下游引物和探针中都含有切口酶的切割识别序列。由于切口酶恒温扩增是通过切口酶切割引物从而进行模板链的延生扩增的，因此上游引物和下游引物中都必须含有切割识别序列。

45、进一步地，所述核酸等温扩增检测体系还包括dna聚合酶；所述等温扩增的温度为50～60℃。

46、本发明提供的dna聚合酶(bst dna聚合酶)和切口酶nt.bstnbi，都正好是在温度为 50～60℃时能更好地发挥作用，从而进行高效率的切口酶恒温扩增，并能进行高灵敏度的核酸检测。因此本发明提供的体系中，dna聚合酶和切口酶nt.bstnbi的组合可谓是恰到好处。

47、在一些方式中，所述引物和探针的核苷酸序列都可以含有2'-o-methyl-修饰。

48、通过对引物或探针进行2'-o-methyl-修饰，可以有效防止错配，防止非特异性扩增，提高扩增效率。因此引物和探针中的碱基可以进行2'-o-methyl-修饰，本发明经研究证明，对引物和探针进行2'-o-methyl-修饰不会影响切口酶的错配切割活性。

49、但需要注意的是，引物和探针中的切割识别序列不能进行2'-o-methyl-修饰(防止影响探针与扩增产物的错配，也防止影响切口酶对切割位点的识别)。

50、另一方面，本发明提供了一种新型冠状病毒的核酸等温扩增检测体系，包括引物探针组和切口酶，所述引物探针组包括：

51、(1)上游引物，具有如seq id no.1所示的核苷酸序列，

52、(2)下游引物，具有如seq id no.2所示的核苷酸序列；

53、(3)探针中含有“5'-gagtc-3'”；

54、所述探针类型为分子信标探针，探针的两端修饰有荧光基团或淬灭基团；所述切口酶为nt.bstnbi。

55、在一些方式中，所述引物探针组包括：

56、上游引物cov-f：5'-ctcgaggacgagtcgttccaattaacacc-3'(seq id no.1)；

57、下游引物cov-r：5'-attcgtctggagtctcttcggtagtagcc-3'(seq id no.2)；

58、探针cov-bpm：5'-fam-gtcatcgagtccagatgagatgac-bhq1-3'(seq id no.3)。

59、探针cov-bpm识别的对应模板靶核酸序列3’-nnnnngtcaggtctactnnnnn-5’，对应模板靶核酸序列中的3’-gtcag-5’能与探针中的5'-gagtc-3'进行错配，使探针被切割，而模板靶序列却不会被切割，与模板靶序列互补的另一条模板靶序列含有5'-cagtc-3'，与切口酶切割识别序列不同，也同样不会被切割。

60、该体系用于新型冠状病毒的n基因的高灵敏度检测。

61、再一方面，本发明提供了一种核酸检测方法，所述方法采用如上所述的核酸等温扩增检测体系对靶核酸模板进行等温扩增，再对等温扩增产物进行核酸检测。

62、再一方面，本发明提供了一种非洲猪瘟的核酸等温扩增检测体系，包括物探针组和切口酶，所述引物探针组包括：

63、(1)上游引物，具有如seq id no.4所示的核苷酸序列；

64、(2)下游引物，具有如seq id no.5所示的核苷酸序列；

65、(3)探针中含有“5'-gagtc-3'”；

66、所述探针类型为分子信标探针，探针的两端修饰有荧光基团或淬灭基团；所述切口酶为nt.bstnbi。

67、在一些方式中，所述引物探针组包括：

68、上游引物afv-f：5'-aggcttaagagtcgcattaaaatgcacc-3'(seq id no.4)；

69、下游引物afv-r：5'-acgggtagagtccccaccttgggaaac-3'(seq id no.5)；

70、探针afv-bp:5'-rox-ttccccatggaaagagtctccgtactggggaa-bhq2-3' (seq idno.6)。

71、该体系用于非洲猪瘟的b646l基因的高灵敏度检测。

72、再一方面，本发明提供了一种肺炎支原体的核酸等温扩增检测体系，包括物探针组和切口酶，所述引物探针组包括：

73、(1)上游引物，具有如seq id no.7所示的核苷酸序列；

74、(2)下游引物，具有如seq id no.8所示的核苷酸序列；

75、(3)探针中含有“5'-gagtc-3'”；

76、所述探针类型为分子信标探针，探针的两端修饰有荧光基团或淬灭基团；所述切口酶为nt.bstnbi。

77、在一些方式中，所述引物探针组包括：

78、上游引物mpf：5'-taatactaatgagtcgcugagtaatactaauu-3'(seq id no.7)；

79、下游引物mpr：5'-cagcgacagagtcaccaaacaaaaacgac-3'(seq id no.8)；

80、探针mpbp：5'-fam-ctgcgtaggcuuccaatgagtcctcgagctacgcag- bhq1-3'(seq idno.9)。

81、该体系用于肺炎支原体的16s基因的高灵敏度检测。

82、进一步地，对肺炎支原体的16s基因检测体系的引物和探针进行2'-o-methyl-修饰，不影响引物、探针的作用及肺炎支原体的检测，2'-o-methyl-修饰后的引物和探针如下：

83、上游引物序列mmpf：5'-taatactaatgagtc mg mc mu mg agtaatact ma ma mumu-3'；

84、下游引物序列mmpr：5'-cagcgacagagtcaccaaacaa ma ma a mc mg a mc-3'；

85、探针序列mmpbp：5'-fam-ctgcgta mg mg mc mu muccaatgagtcct mc mg a mg mctacgcag-bhq1-3'(其中，m前缀代表该碱基经2'-o-methyl-修饰过)。

86、再一方面，本发明提供了切口酶的错配切割活性在制备高灵敏度的核酸等温扩增检测体系的用途，所述核酸等温扩增检测体系含有能与扩增产物结合的探针，所述探针中含有切口酶的切割识别序列；所述扩增产物中含有能与切口酶切割识别序列错配的互补链。

87、在一些方式中，所述切口酶为nt.bstnbi，切口酶的切割识别序列为“5'-gagtc-3'”；所述切口酶的错配切割活性是指：当切口酶的切割识别序列“5'-gagtc-3'”对应的互补碱基为“5'-gacth-3'”，其中h为碱基t、a或g时，不影响切口酶的切割活性。

88、再一方面，本发明提供了一种探针在制备高灵敏度的核酸等温扩增检测体系的用途，探针能与扩增产物结合，所述探针中含有切口酶的切割识别序列；所述扩增产物中含有能与切口酶切割识别序列错配的互补链。

89、再一方面，本发明提供了一种切口酶用于制备高灵敏度的核酸等温扩增检测体系的用途，所述核酸检测体系中含有能与扩增产物结合的探针，所述探针中含有切口酶的切割识别序列；所述扩增产物中含有能与切口酶切割识别序列错配的互补链。

90、在一些方式中，所述核酸检测体系中含有待测靶核酸、引物探针组和切口酶，所述引物探针组包括上游引物、下游引物和探针，上游引物、下游引物和探针中含有切口酶的切割识别序列；所述待测靶核酸中含有能与切口酶切割识别序列错配的互补链。

91、在一些方式中，所述切口酶为nt.bstnbi，切口酶的切割识别序列为“5'-gagtc-3'”；所述切口酶的错配切割活性是指：当切口酶的切割识别序列“5'-gagtc-3'”对应的互补碱基为“5'-gacth-3'”，其中h为碱基t、a或g时，不影响切口酶的切割活性。

92、本发明提供的核酸等温扩增检测体系具有如下的有益效果：

93、1、利用切口酶错配切割的星号活性特征，设计和开发出高效荧光探针，并使用所述荧光探针，开创了一种基于酶切扩增与错配探针二次信号级联放大的检测反应体系；

94、2、扩增出一条单链下游模板后，带有荧光信号的探针与之结合后，形成了具有错配位点的切口识别序列，切口酶会将探针切割后，从而探针释放出荧光，下一条探针可以继续与模板进行结合，往而复始，探针不断被切割并释放出荧光信号；从而使多条荧光探针与一个模板链结合并被切割产生荧光信号，相对与现有的一个探针与一条模板链的结合，本发明的方法能产生更强的荧光信号，进一步应用于核酸的定性或定量检测中，可以显著提高检测的灵敏度，特别是对于微量样本的检测具有重要意义；

95、3、明确了切口酶的错配切割活性：当切口酶的切割识别序列“5'-gagtc-3'”对应的互补链a为“5'-gacth-3'”，其中h为碱基t、a或g时，不影响切口酶的切割活性；而当互补链a“5'-gactc-3'”中的第一个碱基发生突变，从g突变为a、c、t时，切口酶则不能发挥切割作用；

96、4、经过引物和探针序列的大量筛选，实现了新型冠状病毒的高灵敏度的切口酶核酸扩增检测，新型冠状病毒的切口酶等温扩增体系检测的灵敏度达到500拷贝/毫升；

97、5、经过引物和探针序列的大量筛选，实现了非洲猪瘟的高灵敏度的切口酶核酸扩增检测，非洲猪瘟的切口酶等温扩增体系检测的灵敏度达到500拷贝/毫升；

98、6、经过引物和探针序列的大量筛选，实现了肺炎支原体的高灵敏度的切口酶核酸扩增检测，肺炎支原体的切口酶等温扩增体系检测的灵敏度达到200拷贝/毫升；

99、7、发现对引物和探针进行2'-o-methyl-修饰，不影响切口酶核酸扩增体系中的引物、探针的作用及病毒核酸的检测；

100、8、将该高灵敏度的切口酶核酸扩增检测方法应用于poct产品上，例如新冠检测的poct产品上，会具有巨大的市场价值。