早期筛查阿尔茨海默病的试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及筛选阿兹海默症的方法，具体说是早期筛查阿尔茨海默病的试剂盒及其应用。

背景技术：

1、阿茨海默病的发病率也在逐年上升，已成为继心脑血管疾病和肿瘤后第三大危机人类生命健康的疾病。阿尔茨海默病患者大脑的病理改变呈弥漫性脑萎缩，镜下病理改变以老年斑、神经原纤维缠结和神经元减少为主要特征。目前比较公认的阿尔茨海默病发病机制认为β淀粉样蛋白（aβ）的生成和清除失衡是神经元变性和痴呆发生的始动因素，其可诱导tau蛋白过度磷酸化、炎症反应、神经元死亡等一系列病理过程。阿尔茨海默病目前无法治愈，因此早诊断，早预防是关键。现阶段，提早预防和早期诊断是人类与阿尔兹海默病抗争的最有效方式。

2、《中国阿尔茨海默病痴呆诊疗指南（2020年版）》和《阿尔茨海默病的诊疗规范（2020年版）》指出，目前国内针对阿尔茨海默病临床诊断是根据患者及家属提供的详细病史、认知评估，同时进行其他检查包括血液、脑脊液、ct和mri等诊断确诊。参考上海交通大学医学院附属瑞金医院主编的《中国阿尔茨海默病报告2021》，阿尔茨海默病的临床诊断包含：神经影像学检查（mri、ct、pet）；神经心理测评（mmse、moca、ace-ⅲ）；体液标志物检查（脑脊液aβ和tau、血液aβ和tau、尿液ad7c等）；基因检测（app、psen1、psen2、apoe）。目前阿尔茨海默病的临床诊断项目较多，脑脊液取样时需对患者进行腰部穿刺的有创伤害，进行一次神经影像学检查和体液标志物检查费用近万元，对患者家庭造成较大经济压力，且无法实现大范围人群早期筛查，这些问题制约了阿尔茨海默病早筛的推广，导致患者在发病期去医院就诊时往往已经处于中度甚至重度痴呆阶段，对患者和家庭已造成巨大影响。

3、通过国家药品监督管理局（nmpa）官网(nmpa.gov.cn)查询可知，已经完成国产医疗器械注册的阿尔茨海默病检测的试剂盒仅涉及3个标记物，分别为人β淀粉样蛋白1-42(aβ1-42)、人磷酸化tau-181蛋白（p-tau-181）和阿尔茨海默相关神经丝蛋白(ad7c—ntp)，且都是单一指标的检测试剂盒，3个试剂盒的灵敏度大约80-90%，特异性不足80%，在试剂盒分析性能方面有较大的提升空间。

4、本发明建立一个新型试剂盒，在分析性能（灵敏度和特异性）方面均有提升，应用于阿尔茨海默病的早期筛查。

技术实现思路

1、针对现有技术的问题，本发明提供了早期筛查阿尔茨海默病的试剂盒及其应用。

2、本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

3、一种用于早期筛查阿尔茨海默病试剂盒的制备方法，所述制备步骤包括：

4、采集受检者的血液和尿液样本；

5、提取血液样本中的基因组dna；

6、对提取的基因组dna进行apoe基因多态性检测、端粒长度检测；

7、对血液样本离心获得血清/血浆，以及进行端粒酶逆转录酶检测、人β-淀粉样蛋白1-42 、人β-淀粉样蛋白1-40 (aβ1-40）的检测、人总tau蛋白(t-tau)的检测和人磷酸化tau-181蛋白（p-tau-181）的检测；

8、对尿液样本进行阿尔茨海默相关神经丝蛋白的检测。

9、在一实施例中，所述提取血液样本中的基因组dna，包括：

10、s1、取200 μl血液样本，加入200 μl缓冲液gb和20 μl 蛋白酶k的预混溶液， 充分颠倒混匀，56℃放置10 min，其间颠倒混匀数次；

11、s2、室温放置2-5 min后加入350 μl缓冲液bd，充分颠倒混匀；

12、s3、将s2中所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱cg2中， 12,000 rpm(13,400×g )离心30 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cg2放入收集管中；

13、s4、向吸附柱cg2中加入500 μl缓冲液gdb，12,000 rpm(13,400×g )离心30 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cg2放入收集管中；

14、s5、向吸附柱cg2中加入600 μl漂洗液pwb 其中，在使用前请先检查是否已加入无水乙醇， 12,000 rpm (13,400×g )离心30 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cg2放入收集管中；

15、s6、重复操作s5；

16、s7、离心，12,000 rpm(13,400×g )离心2 min，倒掉废液，将吸附柱cg2置于室温放置2 min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

17、s8、将吸附柱cg2转入1.5 ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50 μl洗脱缓冲液tb，室温放置2 min，12,000 rpm (13,400×g) 离心2 min，将溶液收集到离心管中。dna产物应保存在-20℃，以防dna降解 。

18、在一实施例中，所述对提取的基因组dna进行apoe基因多态性检测，采用taqman探针技术，对人类apoe基因2个多态性位点c.526c>t（rs7412）和c.388t>c（rs429358），设计2套特异性引物和探针组合，在一个反应体系中通过两种不同通道对检测一个位点的基因多态性。

19、在一实施例中，所述对对提取的基因组dna进行端粒长度检测，包括，

20、s1、端粒基因相对含量的检测；

21、s2、内参基因相对含量的检测；

22、s3、得出端粒相对长度，根据端粒长度的检测原理：端粒相对含量除以对应的内参基因相对含量，结果即为端粒的相对长度，包括，

23、根据定量结果，获取标准品及样品的扩增曲线及ct值；

24、计算标准品的ct平均值，分别与端粒和内参基因的对数值作图，获得相关趋势线；

25、将样本的ct值代入上一步所得公式，计算相应的内参基因和端粒的相对含量；

26、将上一步获得的端粒相对含量除以对应的内参基因相对含量，获得结果即为样本每份基因组dna的端粒的相对长度。

27、在一实施例中，所述对血液样本离心获得血清/血浆，以及进行端粒酶逆转录酶检测、人β-淀粉样蛋白1-42 、人β-淀粉样蛋白1-40 (aβ1-40）的检测、人总tau蛋白(t-tau)的检测和人磷酸化tau-181蛋白（p-tau-181）的检测，包括，

28、s1、标准品的稀释；

29、s2、加样：其中，分别设空白孔、标准孔、待测样品孔；其中，空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同，在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；

30、s3、温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟；

31、s4、配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用；

32、s5、洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；

33、s6、加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外；

34、s7、温育：操作s3；

35、s8、洗涤：操作s5；

36、s9、显色：每孔先加入显色剂a过氧化氢50μl，再加入显色剂b3,3',5,5'-四甲基联苯胺50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟；

37、s10、终止：每孔加终止液50μl，终止反应，其中，此时蓝色立转黄色；

38、s11、测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（od值）， 测定应在加终止液后15分钟以内进行；

39、s12、计算：以标准物的浓度为横坐标，od值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的od值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与od值计算出标准曲线的直线回归方程式y=ax+b，y表示od值，x表示浓度值，a和b每个标准曲线为固定值，将样品的od值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

40、在一实施例中，所述对尿液样本进行阿尔茨海默相关神经丝蛋白的检测，包括，

41、s1、标准品的稀释；

42、s2、加样：其中，分别设空白孔、标准孔、待测样品孔；其中，空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同，在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl，即可样品最终稀释度为5倍，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；

43、s3、温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟；

44、s4、配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用；

45、s5、洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；

46、s6、加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外；

47、s7、温育：操作s3；

48、s8、洗涤：操作s5；

49、s9、显色：每孔先加入显色剂a过氧化氢50μl，再加入显色剂b3,3',5,5'-四甲基联苯胺50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟；

50、s10、终止：每孔加终止液50μl，终止反应，其中，此时蓝色立转黄色；

51、s11、测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（od值），测定应在加终止液后15分钟以内进行；

52、s12、计算：以标准物的浓度为横坐标，od值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的od值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与od值计算出标准曲线的直线回归方程式y=ax+b，y表示od值，x表示浓度值，a和b每个标准曲线为固定值，将样品的od值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

53、一种早期筛查阿尔兹海默病试剂盒的应用，

54、apoe基因多态性：如果表型为apoe4的话，评分积分为0.3，否则评分积分为0；

55、端粒长度：如果端粒的相对长度小于1，评分积分为0.8，否则评分积分为0；

56、端粒酶逆转录酶：如果端粒酶逆转录酶结果小于0.1u/l，评分积分为0.4，否则评分积分为0；

57、人β-淀粉样蛋白1-42 (aβ1-42）：如果aβ1-42结果小于4.7pg/ml，评分积分为1，否则评分积分为0；

58、人β-淀粉样蛋白1-40 (aβ1-40）：如果aβ1-42/40比值小于0.05，评分积分为1，否则评分积分为0；

59、人总tau蛋白(t-tau)：如果t-tau结果大于6pg/ml，评分积分为1，否则评分积分为0；

60、人磷酸化tau-181蛋白（p-tau-181）：如果p-tau-181结果大于30pg/ml，评分积分为1，否则评分积分为0；

61、阿尔茨海默相关神经丝蛋白(ad7c—ntp)：如果ad7c—ntp结果大于1500pg/ml，评分积分为0.9，否则评分积分为0；

62、总评分积分相加后，大于或等于1的受检者为阳性，表示受检者可能患有阿尔茨海默病或处于阿尔茨海默病临床前期阶段，需要进一步进行临床确诊；反之，如果小于1，表示受检者患有阿尔茨海默病的可能性低，但并不能完全排除疾病风险。

63、本发明的有益效果：

64、1、本发明所述的早期筛查阿尔茨海默病的试剂盒及其应用，本发明与现有阿尔茨海默病传统的诊疗以及相关指南中提到的检测方法相比，无需进行腰椎穿刺和影像学检查，只需要采集受检者的血液以及尿液即可完成检查，使得受检者的接受度更高，且检查的准确性满足阿尔茨海默病大数量人群的早期筛查；

65、2、本发明所述的早期筛查阿尔茨海默病的试剂盒及其应用，本发明是结合8个指标结果数据的深度学习算法分析，得出最终的风险结论，通过直观的数字表达更利于医生判读，代替了现有诊疗手段中通过多项检验和影像检查后依靠临床医生看完每一张报告单再综合下结论。