一种用于检测猴痘病毒的crRNA靶点及CRISPR-Cas13a系统

本发明属于分子诊断，涉及一种用于检测猴痘病毒的crrna靶点及crispr-cas13a系统。

背景技术：

1、猴痘是动物传播的一种以皮肤出疹为特征的热性病毒性疾病，通过直接密切接触，可由动物传染给人，并可在人与人之间传染，属人畜共患传染病。猴痘病毒检测方法有血清学方法，但猴痘病毒与痘病毒之间存在抗原交叉，特异性不够，不能准确检测猴痘病毒，此外还有病原分离方法，但检测周期太长，且猴痘病毒被分类为生物安全ⅲ级生物因子，对实验室生物安全要求极高。因此，两种方法在实际应用中存在一定的局限性。利用pcr方法对猴痘病毒核酸进行检测，灵敏度高，快速仅需几小时即可得到结果，国外也已有相关报导，但国内就此方面的报道还为数不多。目前主要检测技术为荧光定量pcr法，该方法稳定、可靠、具有一定的灵敏度，但样本处理复杂，且对仪器要求高。

2、2017年4月，美国研究人员建立了一种灵敏度达到埃摩级(单拷贝)，特异性达到单碱基的核酸检测技术——基于crispr-cas13a的核酸检测平台sherlock(specific highsensitivity enzymatic reporter unlocking)，利用leptotrichia wadei cas13a蛋白(lwcas13a)的非特异剪切活性，结合可以高效扩增目的片段的重组聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification，rpa)，实现了对痕量核酸快速、廉价、高灵敏的检测。

技术实现思路

1、本发明的第一个目的是提供一种用于检测猴痘病毒的crispr-cas13a系统。

2、本发明提供的用于检测猴痘病毒的crispr-cas13a系统包括cas13a蛋白和crrna，或二者形成的复合体；

3、所述crrna包括用于与cas13a蛋白结合的锚定序列和靶向猴痘病毒靶点序列的向导序列；

4、所述猴痘病毒的靶点序列位于猴痘病毒基因组(geneid:9289998)第46456-46483位。

5、上述crispr-cas13a系统中，所述猴痘病毒靶点序列为序列1。

6、上述crispr-cas13a系统中，所述crrna序列为序列2。其中，序列2第1-38位为用于与cas13a蛋白结合的锚定序列；序列2第39-66位为靶向猴痘病毒靶点序列的向导序列。

7、上述crispr-cas13a系统中，所述cas13a蛋白为lwcas13a蛋白。

8、本发明的第二个目的是提供一种用于检测猴痘病毒的试剂盒。

9、本发明提供的用于检测猴痘病毒的试剂盒包括上述用于检测猴痘病毒的crispr-cas13a系统。

10、进一步的，所述试剂盒还包括用于特异性扩增猴痘病毒靶点序列的引物对；所述引物对由序列4所示的单链dna分子和序列5所示的单链dna分子组成。

11、更进一步的，所述试剂盒还包括用于特异性扩增猴痘病毒靶点序列的其他试剂和用于检测扩增产物的其他试剂。所述用于特异性扩增猴痘病毒靶点序列的其他试剂包括缓冲液和/或ddh2o；所述用于检测扩增产物的其他试剂包括如下试剂中的全部或部分：lwcas13a蛋白、ntp(如ntp mix)、t7 rna聚合酶、rna酶抑制剂、报告rna(具有信号报告功能的荧光报告rna或用于试纸检测的报告rna)、rnase free water。

12、所述试剂盒还可包括记载有如下判定标准甲或判定标准乙的载体：

13、crispr-cas13a荧光检测体系的判定标准甲：若在同一检测时间内，待测样本检测体系的荧光强度值比阴性对照(ddh2o)荧光强度值高3倍以上(包括待测样本检测体系的荧光强度值比阴性对照荧光强度值高3倍的情况)，或任何时候待测样本检测体系的荧光强度值大于或等于0.2a.u.，则待测样本含有或候选含有猴痘病毒，否则待测样本不含有或候选不含有猴痘病毒。

14、crispr-cas13a试纸体系判定标准乙：测反应后体系滴在试纸上后2-5分钟进行判读，若试纸没有“t”线显现且有“c”线显现，则待测样本含有或候选含有猴痘病毒；若试纸有“t”线显现且有“c”线显现，则待测样本不含有或候选不含有猴痘病毒；若试纸没有“c”线显现，则试纸失效，需更换试纸重新实验。

15、本发明的第三个目的是提供如下任一物质：

16、a1)上述crrna；

17、a2)上述cas13a蛋白和crrna，或者二者形成的复合体；

18、a3)上述引物对。

19、本发明的第三个目的是提供如下任一应用：

20、b1)上述系统或上述试剂盒或上述物质在检测或辅助检测猴痘病毒中的应用；

21、b2)上述系统或上述试剂盒或上述物质在制备检测或辅助检测猴痘病毒的产品中的应用；

22、b3)上述系统或上述试剂盒或上述物质在检测或辅助检测待测样本中是否含有猴痘病毒中的应用；

23、b4)上述系统或上述试剂盒或上述物质在制备检测或辅助检测待测样本中是否含有猴痘病毒的产品中的应用；

24、b5)上述系统或上述试剂盒或上述物质在筛选或辅助筛选猴痘病毒防治药物中的应用；

25、b6)上述系统或上述试剂盒或上述物质在制备筛选或辅助筛选猴痘病毒防治药物的产品中的应用；

26、b7)上述物质在制备上述试剂盒中的应用。

27、本发明的最后一个目的是提供一种检测或辅助检测猴痘病毒的方法。

28、本发明提供的检测或辅助检测猴痘病毒的方法包括如下步骤：

29、c1)以待测样本的核酸为模板，采用由序列4所示的单链dna分子和序列5所示的单链dna分子组成的引物对进行raa扩增，得到raa产物；

30、c2)配制含有如下组分的crispr-cas13a检测体系：所述raa产物、cas13a蛋白、上述crrna、报告rna、ntp、t7 rna聚合酶、rna酶抑制剂；同时以水(ddh2o)替代所述pcr产物作为阴性对照；反应；

31、c3)将所述crispr-cas13a检测体系反应，检测反应产物，从而判断待测样本是否含有猴痘病毒。

32、上述反应为荧光体系反应c3)-1或试纸条体系反应c3)-2：

33、c3)-1：所述crispr-cas13a检测体系，且crispr-cas13a检测体系中的rna为荧光报告rna，将该crispr-cas13a检测体系放入荧光定量pcr仪中反应，检测荧光强度，根据荧光强度的大小判定所述待测样本中是否含有猴痘病毒：若在同一检测时间内，待测样本检测体系的荧光强度值比阴性对照(ddh2o)荧光强度值高3倍以上(包括待测样本检测体系的荧光强度值比阴性对照荧光强度值高3倍的情况)，或任何时候待测样本检测体系的荧光强度值大于或等于0.2a.u.，则待测样本含有或候选含有猴痘病毒，否则待测样本不含有或候选不含有猴痘病毒；

34、c3)-2：所述crispr-cas13a检测体系进行反应，且crispr-cas13a检测体系中的rna为试纸检测的报告rna，用试纸检测反应产物，根据“t”线是否消失且“c”线显现判定所述待测样本中是否含有猴痘病毒：若在同一检测时间内，待测样本检测体系的“t”线消失且“c”线显现，则待测样本含有或候选含有猴痘病毒，否则待测样本不含有或候选不含有猴痘病毒。

35、进一步的，步骤c1)中，所述raa扩增的反应条件为：39℃反应20-40分钟；

36、上文中步骤c3)-1中，所述反应的条件为：37℃，每2min读取一次荧光强度值，读取40次。

37、上文中步骤c3)-2中，所述反应的条件为：37℃，反应30min。

38、更进一步的，所述待测样本可为血液样本、器官(如肝、脾、肾等)组织样本、细胞等。

39、本发明所提供的检测或辅助检测猴痘病毒的方法既可为非疾病诊断治疗方法，也可为疾病诊断治疗方法。其中，所述非疾病诊断治疗方法可如在细胞水平筛选猴痘病毒防治药物时检测用药前后细胞内是否含有猴痘病毒。

40、本发明基于crispr-cas13a核酸检测技术，通过设计、构建、筛选，最终提供一段用于猴痘病毒检测的靶点序列及能靶向该靶点序列的特异性crrna，该crrna可通过激活cas13a实现对猴痘病毒核酸的高灵敏、高特异检测，灵敏度达到十拷贝(10copy/μl)。