一种热杀索丝菌噬菌体及其在低温保鲜中的应用

1.本发明属于微生物领域，具体涉及一种热杀索丝菌噬菌体及其在低温保鲜中的应用。


背景技术：

2.热杀索丝菌(brochothrix thermosphacta，bt)属革兰氏阳性兼性厌氧菌，是冷鲜肉制品的优势腐败菌。bt在0-30℃，ph 5.0-9.0条件下生长迅速，致腐能力极强，并在腐败过程中的最终形成优势菌群。bt广泛分布于环境、真空包装和气调包装食品中，因其具有兼性厌氧和嗜冷特性，在真空包装和冷藏条件下能够利用牛、羊、猪肉及水产品中营养物质生长繁殖。bt被认为是冷藏温度下食品腐败变质的重要危害细菌，不仅造成重大经济损失，而且给人类健康带来极大危害。冷鲜制品的bt污染控制目前尚无有效手段，深入研究冷鲜肉产品中bt减除技术及其加工贮藏过程中bt污染的控制，对于延长冷鲜肉产品的货架期，防止品质劣变，保障食品安全具有重要意义。目前用于控制食品中腐败细菌生长的常规保鲜剂主要有化学防腐剂，近年来出于对食品安全和绿色保鲜的需求，人们利用从动植物、微生物中提取的天然成分作为生物抑菌剂，但这些保鲜剂虽能抑制部分腐败菌的生长，但往往低温保鲜效果不佳、并且制备成本高。
3.噬菌体是一类细菌依赖性的病毒，感染宿主细菌后，可在宿主细胞内快速增殖并裂解细胞，产生特异性抑菌作用。此外，噬菌体广泛存在于自然界中，并且对宿主菌具有专一性，制备成本低廉，安全性好。bt是冷藏水产品、肉制品中的优势腐败菌，开发以bt噬菌体作为主要成分的生物控制剂或保鲜剂，对于减少冷鲜水产品、肉制品的低温腐败，提升产品品质具有潜在价值，但目前尚无相关研究报道。


技术实现要素：

4.发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种对热杀索丝菌生长具有抑制作用的噬菌体，其可以应用在食品生产和冷藏的保鲜中，尤其是能够抑制冷链流通中水产品和肉制品中由热杀索丝菌增殖引起的腐败变质，延长产品货架期。
5.本发明还提供所述噬菌体的应用，该噬菌体可以单独或复配制备保鲜剂或生物控制剂，能够有效抑制冷藏条件下水产品、肉制品中由热杀索丝菌生长与代谢引起的腐败和品质劣变，为冷鲜水产品、肉制品保鲜和货架期延长提供一种安全、高效、廉价的生物制剂。
6.一种热杀索丝菌(brochothrix thermosphacta)噬菌体btpyzu01，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2022年5月30日，保藏地址：武汉，武汉大学；保藏编号为cctcc no：m 2022762。
7.本发明所述的噬菌体btpyzu01在抑制热杀索丝菌中的应用。
8.其中，所述噬菌体btpyzu01在抑制水产品或者肉制品中热杀索丝菌中的应用。
9.其中，所述噬菌体btpyzu01在抑制用于水产品或者肉制品保鲜及其生产环境或保藏运输器具中热杀索丝菌中的应用。
10.其中，所述水产品或者肉制品为肉类、淡水产品，海产品，或它们单独或组合加工的固体或液体类制品。
11.其中，所述噬菌体btpyzu01在抑制冷鲜食品加工、低温储存过程中热杀索丝菌代谢和繁殖中的应用。
12.本发明所述的噬菌体btpyzu01在制备抑制热杀索丝菌的喷洒液、淋洗液、保鲜剂或生物控菌剂中的应用。
13.其中，所述噬菌体btpyzu01分离物或培养物单独或者与现有抑菌剂混合在制备抑制热杀索丝菌的喷洒液、淋洗液、保鲜剂或生物控菌剂中的应用。
14.其中，纯化的噬菌体btpyzu01制成喷洒液或淋洗液，用于对生产环境、生产器具的喷洒或洗涤，减少食品加工过程中热杀索丝菌污染；或者将纯化的噬菌体作为保鲜剂，在配料和贮藏时加入，用于抑制冷鲜食品加工、低温储存过程中热杀索丝菌代谢和繁殖。
15.本发明中的热杀索丝菌噬菌体btpyzu01具有以下生物学特征：
16.(1)形态学特征：通过透射电镜观察，头部对称，直径约为53nm，尾长约为110nm，无伸缩性尾鞘，获得的噬菌体的形态学特征归于长尾噬菌体科。
17.(2)核酸类型：噬菌体为dsdna。
18.(3)基因组特征：基因组全长为34645bp，其中，编码基因总长度为33045bp，平均长度为635bp，占总长的95.4％；gc含量为37.68％，有52个开放阅读框(orfs)，其中1个orfs(序列为：5
’‑
gtgagtaatcaatcacccggttgtgataaatgttatgcgaatagttatgttatacaaggtgaaaatctacaaatcgtaagatttagtagaatgttgcaaatcgttagtcatcctactattgcagacgagggaggaattgaatcaatgtgtattaatatgaacttttgtcccgattgcggacacgattacaataatgacgaaaaatttaaagaggaggaaaaaataaatgaataa-3’)在现有数据库中搜不到同源性基因，5个orfs编码蛋白为假设蛋白，有45个orfs编码蛋白功能明确；经ncbi数据库全基因组比对发现，与噬菌体btpyzu01最为接近的一株噬菌体(热杀索丝菌噬菌体nf5)的同源性为94.13％(同源性低)，基因组数据显示btpyzu01为一种新型噬菌体。
19.(4)具有强烈的热杀索丝菌裂解性能。
20.(5)在4-25℃温度下能够有效抑制食品基质中热杀索丝菌繁殖。
21.本发明将上述热杀索丝菌噬菌体btpyzu01制备成一种微生态制剂，用作食品冷藏保鲜中的保鲜剂，制备方法特征在于：分别取100μl btpyzu01噬菌体液与相应对数生长期的热杀索丝菌菌液100μl混合，室温放置10min，然后加到10ml lb液体培养基中，25℃，150rpm恒温振荡过夜培养；将试管中的培养物转至灭菌离心管中，经8000
×
g，10min离心后收集上清液，通过0.22μm微孔滤膜过滤除菌，得到噬菌体增殖液。加0.93g peg 8000，0.58g nacl，摇匀至溶解，4℃过夜；10000
×
g 4℃离心20min，去上清液；加0.5ml sm(1l：nacl 5.8g，mgso4.7h2o 2.0g，1m tris-hcl(ph7.4)50ml)溶液，室温作用1h；通过加入等体积的氯仿抽提30s；3000
×
g 4℃离心15min回收含有噬菌体颗粒的亲水相。将获得的纯化的btpyzu01噬菌体颗粒与sm缓冲液按1：10比例混合形成噬菌体制剂母液。
22.有益效果：与现有技术相比较，本发明分离筛选到一种新型噬菌体，有效用于控制水产品、肉制品的低温腐败等。采用噬菌体btpyzu01特异性裂解热杀索丝菌，并有效抑制热杀索丝菌的繁殖和代谢，防止冷链流通中水产品和肉制品的品质劣变，延长货架期。
23.由于本发明的噬菌体btpyzu01通过传统的方法很容易配制成喷洒液或淋洗液，对
环境或器具进行除菌，降低生产环境中热杀索丝菌对冷鲜产品的污染风险；本发明涉及的噬菌体属于天然生物材料，具有宿主专一性，没有毒副作用，可以作为冷鲜食品的专用保鲜剂或生物控制剂。
24.本发明提出了一种低温致腐菌-热杀索丝菌(brochothrix thermosphacta)噬菌体，其作为生物抑菌剂在水产和肉制品冷藏保鲜中的应用。本发明的热杀索丝菌噬菌体btpyzu01可以运用在低温保鲜中，其制剂能够抑制冷藏水产品、肉制品及其环境中热杀索丝菌的生长，有效控制产品低温劣变，延长产品货架期。
附图说明
25.图1噬菌体btpyzu01噬菌斑形态测定结果。
26.图2噬菌体btpyzu01微观形态电镜照片。
27.图3噬菌体btpyzu01全基因组图谱。
28.图4噬菌体btpyzu01在25℃对培养基中热杀索丝菌的抑制效果。(图中，
■
表示不含有噬菌体btpyzu01(0pfu/ml)的lb培养基中热杀索丝菌生长情况；
●
表示含有106pfu/ml的lb培养基中热杀索丝菌生长情况；
▲
表示含有105pfu/ml的lb培养基中热杀索丝菌生长情况；
▼
表示含有104pfu/ml的lb培养基中热杀索丝菌生长情况；表示含有103pfu/ml的lb培养基中热杀索丝菌生长情况，所有数据点为3次试验od600nm值的平均值。)
29.图5噬菌体btpyzu01在25℃对鱼汁中热杀索丝菌的抑制效果。(图中，空心柱表示不含有噬菌体btpyzu01的鱼汁中热杀索丝菌活菌总数；实心柱表示含有106pfu/ml噬菌体btpyzu01的鱼汁中热杀索丝菌活菌总数，所有数据点为25℃保藏下3次试验的lgcfu/ml平均值，灰色虚线表示起始热杀索丝菌活菌数。)
30.图6噬菌体btpyzu01在4℃对鱼汁中热杀索丝菌的抑制效果。(图中，空心柱表示不含有噬菌体btpyzu01的鱼汁中热杀索丝菌活菌总数；实心柱表示含有106pfu/ml噬菌体btpyzu01的鱼汁中热杀索丝菌活菌总数，所有数据点为4℃保藏下3次试验lgcfu/ml的平均值，灰色虚线表示起始热杀索丝菌活菌数。)
具体实施方式
31.以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
32.本发明中的原料和试剂如无特殊说明，均为商业化市售。
33.本发明试验用噬菌体宿主菌热杀索丝菌(brochothrix thermosphacta，菌株号：bt-atcc11509，购置于由美国典型培养物保藏中心(atcc)保藏。
34.sm缓冲液(1l：nacl 5.8g，mgso4·
7h2o 2.0g，1m tris-hcl(ph7.5)50ml)
35.实施例1
36.热杀索丝菌噬菌体分离、纯化及制备
37.本发明样品采自江苏扬州农贸市场污水，取6ml污水样品放入10ml离心管中，8000rpm离心10min，取5ml上清液加入到5ml lb液体培养基中，同时加入100μl对数生长期的热杀索丝菌bt-atcc11509，放置25℃150rpm摇床过夜培养，次日，将各试管中的培养物转至无菌离心管中，8000rpm离心10min，取上清过0.22μm滤膜，获得噬菌体裂解液，放置在4℃冰箱中保存。
38.应用点斑法判断噬菌体活性。取5mllb半固体培养基和100μl对数生长期的热杀索丝菌bt-atcc11509混匀，倾倒固体培养基；凝固后，用移液器在培养基指定区域(培养基中心或把培养基等分)滴加上述噬菌体裂解液10μl，静置晾干，25℃培养8h，观察有无裂解圈形成。
39.取上述能够产生裂解圈的噬菌体裂解液，采用双层平板法分离裂解性噬菌体。将噬菌体裂解液用无菌sm缓冲液进行梯度稀释，取100μl合适稀释度的噬菌体裂解液，与100μl对数生长期的热杀索丝菌bt-atcc11509培养物充分混匀，加入5ml lb琼脂半固体培养基，混匀，快速倾倒在固体营养琼脂培养基上，制成双层平板，于25℃恒温培养，观察有无噬菌斑的生成。
40.在上述出现噬菌斑的平板上挑取单个空斑，放入1ml sm缓冲液中，涡旋混匀，取100μl将噬菌体液用无菌sm缓冲液进行梯度稀释，按上述方法取合适稀释度的噬菌体液与热杀索丝菌混合制备双层平板，25℃培养6-8h，观察噬菌斑的生成。重复上述步骤至少3次，得到的噬菌斑大小一致，即认为得到纯噬菌体btpyzu01。获得的纯化噬菌体，用双层平板检测纯化噬菌体裂解效果，在纯化好的双层中挑取单个噬菌体空斑于1ml sm缓冲液中，混匀，4℃放置24h；于次日取上清，用0.22μm微孔滤膜过滤，即得噬菌体纯化液分离液。用双层平板检测噬菌体纯化液滴度，具体程序为：用sm缓冲液对噬菌体纯化液进行10倍梯度稀释，取各稀释度的噬菌体稀释液100μl与100μl对数生长期的宿主菌制成双层平板，凝固后倒置放在25℃恒温培养箱中培养12h，对形成的空斑进行人工计数，计算滴度。结果显示，btpyzu01对热杀索丝菌产生强烈的裂解效应，噬菌斑直径为0.6-1mm(如图1所示)，计数结果显示裂解液的效价达到109pfu/ml以上。
41.实施例2
42.噬菌体微观形态特征
43.用透射电镜观察噬菌体形态特征。取100μl btpyzu01噬菌体液(109pfu/ml)与对数生长期的热杀索丝菌bt-atcc11509菌液100μl混合，室温放置10min，然后加到10ml lb液体培养基中，25℃，150rpm恒温振荡过夜培养；将试管中的培养物转至灭菌离心管中，经8000
×
g，10min离心后收集上清液，通过0.22μm微孔滤膜过滤除菌，得到噬菌体增殖液。加0.93g peg 8000，0.58g nacl，摇匀至溶解，4℃过夜；10000
×
g 4℃离心20min，去上清液；加0.5ml sm(1l：nacl 5.8g，mgso4.7h2o 2.0g，1m tris-hcl(ph7.4)50ml)溶液，室温作用1h；通过加入等体积的氯仿抽提30s；3000
×
g 4℃离心15min回收含有噬菌体颗粒的亲水相。将获得的纯化的btpyzu01噬菌体颗粒采用磷钨酸负染色法，将铜网有膜的一面朝上，取10μl噬菌体悬液滴于铜网上，吸附15min后用吸水纸吸干水分，取出铜网，在空气中自然干燥2-3min。然后在铜网上滴一滴2％的磷钨酸(pta)水溶液进行染色，2min后取下，用吸水纸吸干水分，在空气中干燥5min，用透射电镜观察，选取清晰的噬菌体图像进行拍照分析。
44.结果如图2所示，噬菌体btpyzu01头部对称，直径约为53nm，尾长约为110nm，无伸缩性尾鞘，属于长尾噬菌体科。
45.实施例3
46.噬菌体全基因组特征
47.取噬菌体纯化液(109pfu/ml)加dnase i至终浓度5μg/ml，rnase a至1μg/ml，37℃温育1h；加入edta(ph 8.0)至终浓度20mmol/l；加蛋白酶k至终浓度50μg/ml，加sds至终浓
度0.5％，混匀，56℃
×
1h；加入等体积平衡酚(ph 8.0)振荡抽提，5000
×
g，离心10min，收集上层水相；用等体积氯仿再抽提一次，5000
×
g，离心10min，收集上层水相；加入1/10体积3mol/l naac(ph 5.2)，再加入两倍体积的无水乙醇沉淀核酸，-20℃过夜，4℃，12000
×
g离心10min；沉淀用70％乙醇和无水乙醇各洗涤一次，去乙醇，空气中干燥沉淀；用适量te(ph 8.0)混悬沉淀，在genequant核酸定量仪上粗略定量，暂按ds dna设置参数，-20℃保存；提取的噬菌体dna送至深圳恒创基因生物有限公司由illumina hiseq2500pe150平台进行全基因组测序及分析。
48.噬菌体btpyzu01全基因组图谱结果如图3所示，经分析，btpyzu01基因组全长为34645bp，其中编码基因总长度分别为33045bp，平均长度分别为635bp，占总长的95.4％，gc含量为37.68％，有52个开放阅读框(orfs)。52个orfs编码蛋白中有1个orfs在数据库中搜不到同源性基因，51个orfs编码的蛋白在数据库中找到同源性序列，其中5个orfs编码的蛋白为假设蛋白，有45个蛋白序列功能明确，基因组数据显示btpyzu01为一种新的噬菌体。结合噬菌体的生理生化特征，鉴定为热杀索丝菌噬菌体，命名为热杀索丝菌(brochothrix thermosphacta)噬菌体btpyzu01。将该噬菌体保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc)，保藏地址：武汉武汉大学；保藏编号：cctcc no：2022762；保藏时间为2022年5月30日。
49.实施例4
50.噬菌体btpyzu01对热杀索丝菌的抑制作用
51.取对数生长期的热杀索丝菌bt-atcc11509用lb液体培养基进行稀释，形成最终浓度为1
×
104cfu/ml的菌悬液，设置以下实验分组测定不同浓度的噬菌体btpyzu01对热杀索丝菌的抑制效果。试验组：在96孔板中每孔分别加入200μl菌悬液(104cfu/ml)和20μl噬菌体btpyzu01悬液(浓度分别为103pfu/ml、104pfu/ml、105pfu/ml、106pfu/ml)；对照组：在96孔板每孔中加入200μl菌液(104cfu/ml)；空白组：每孔加200μl lb液体培养基。25℃培养24h，利用自动生长曲线仪测定600nm处的od值。每组平行测定3次。
52.结果如图4所示，试验组中，加入103pfu/ml、104pfu/ml、105pfu/ml、106pfu/ml btpyzu01悬液的试验组测得的od
600nm
显著低于对照组，表明btpyzu01抑制了热杀索丝菌的生长；其中含有106pfu/ml btpyzu01的培养基孔在整个培养过程中od
600nm
值没有发生变化，表明热杀索丝菌生长被完全抑制。效价高于106完全被抑制。
53.实施例5
54.噬菌体btpyzu01在鱼汁中对热杀索丝菌生长抑制作用
55.为了确定噬菌体btpyzu01能否在含有鱼类成分的基质中对热杀索丝菌bt-atcc11509产生抑制作用，测定了btpyzu01在鱼汁模型中的抑制作用。将新鲜鱼肉切块称重，按质量比1:1加水煮沸10min，用纱布过滤，取肉块重新添加等质量水，继续煮沸5min，取鱼汁用滤纸过滤，用naoh调节ph为7，分装至锥形瓶中，121℃灭菌15min备用。将热杀索丝菌过夜培养物(108cfu/ml)用生理盐水10倍稀释至106cfu/ml。将噬菌体btpyzu01扩增液(109pfu/ml)分别用sm缓冲液梯度稀释至终浓度为108pfu/ml。
56.鱼汁模拟污染模型设计：对照组在10ml鱼汁加入100μl热杀索丝菌悬液(106cfu/ml)+100μl sm缓冲液；噬菌体处理组，每管加入100μl热杀索丝菌悬液(106cfu/ml)+100μl浓度分别为108pfu/ml的噬菌体悬液，充分混匀；每组设置3个平行。将处理的鱼汁分成两组
保藏，第1组于25℃恒温保藏12h，每2小时取样，利用稀释涂布法测定热杀索丝菌活菌数(lgcfu/ml)。第2组于4℃条件下恒温保藏72h，每12小时取样分析，利用稀释涂布法测定热杀索丝菌活菌数(lgcfu/ml)。比较两种保藏温度下对照组和噬菌体处理组的活菌数差异，分析抑制作用。
57.结果显示：在25℃恒温保藏中，对照组热杀索丝菌在鱼汁中迅速生长，12h后比起始活菌数上升2.79lgcfu/ml，而噬菌体处理组中热杀索丝菌活菌数在保藏期内均低于起始活菌数(即保藏试验开始第0h测得的活菌数)(如图5所示)。在4℃条件下恒温保藏72h，结果显示热杀索丝菌活菌数在保藏期内逐渐上升，保藏72h后比起始活菌数上升了2.54lgcfu/ml，噬菌体处理后，保藏期内均没有超过起始活菌数(如图6所示)。结果表明：4℃-25℃条件下，热杀索丝菌在含有鱼类成分的基质中能够快速生长，添加一定数量噬菌体btpyzu01，能够完全抑制热杀索丝菌生长，起到保鲜防腐作用，并可以有效用于控制水产品、肉制品的低温腐败。