提高氧化葡萄糖酸杆菌1,3-二羟基丙酮产量和生产强度的方法

本发明涉及提高氧化葡萄糖酸杆菌1,3-二羟基丙酮产量和生产强度的方法，属于发酵工程。

背景技术：

1、1,3-二羟基丙酮(dihydroxyacetone,dha)是最简单的三碳酮糖，外观白色或乳白色粉末状结晶，具有甜凉味，易吸湿并分解。1,3-二羟基丙酮能在皮肤上形成薄膜防止水分蒸发，而且1,3-二羟基丙酮还可以与皮肤表层的角质层细胞发生席夫碱反应，从而会使皮肤表层颜色变成棕色，这个可以与晒太阳达到类似的效果，因此，在化妆品中可以被用作防晒剂。根据这种功效还可以减少因过度的紫外线照射可能带来的皮肤性疾病，例如白斑和白癜风等皮肤性疾病。

2、1,3-二羟基丙酮生产方法主要有化学合成法和微生物合成法。化学法合成法的特点主要是难以在生产条件与原来成本之间找到一个合适的平衡点，因为当生产条件相对简单时原料成本要求高，当原料成本低时生产条件却要求高，而且在合成过程中还需要贵重金属参与。该方法生产1,3-二羟基丙酮存在很多弊端主要包括产物纯度低、副产物多、环境污染严重及产物分离纯化成本高，因此采用化学法生成1,3-二羟基丙酮越来越受到限制。相较而言，微生物合成法由于其反应条件温和、专一性强和底物利用率高，而在工业中被主要采用。此外，微生物发酵工艺对环境污染小、产品相对易于分离纯化而且生产成本也较低。从技术的经济性和环境的友好性来看，微生物发酵法可以很好的避开化学合成方法存在的弊端，相对来说更具发展潜力；而且1,3-二羟基丙酮在工业生产的过程中可以以氧化葡萄酸杆菌为宿主，通过微生物发酵法转化甘油生产1,3-二羟基丙酮，该方法操作流工艺简单、易于操作控制、成本低而且生产周期短，因此该方法成为了目前国内外生产1,3-二羟基丙酮的主要手段。

3、氧化葡萄酸杆菌中存在很多种多元醇脱氢酶，一般这些脱氢酶也会被称为甘油脱氢酶。该类酶可以氧化具有bertrand-hudson构象的糖醇，如甘油、山梨醇、葡萄糖酸等。在这些酶大多是乙醇、山梨醇和甘油脱氢酶，它们的辅基大多是吡咯并喹啉(pyrroloquinolinequinone，pqq)。其中甘油是具有这种构象的最简单分子，而且目前以甘油为底物生产1,3-二羟基丙酮是国内外研究的热点之一。但是目前，以甘油为底物生产1,3-二羟基丙酮的产量还较低，无法适应目前的工业化生产。

技术实现思路

1、针对目前1,3-二羟基丙酮产量的较低、还无法满足工业化生产的问题，本发明为了进一步提高氧化葡萄酸杆菌生产1,3-二羟基丙酮的能力，通过敲除与其代谢通量有潜在关系的脱氢酶基因，构建得到一系列重组菌，从而获得了结果发现重组菌株的1,3-二羟基丙酮的产量、转化率及生产强度均比对照高。为了解决上述问题，本发明提供一种通过敲除影响1,3-二羟基丙酮代谢通量的脱氢酶基因，从而增强1,3-二羟基丙酮发酵的生产强度和转化率的方法。

2、本发明的第一个目的是提供生产1,3-二羟基丙酮的基因工程菌，所述基因工程菌是敲除氧化葡萄糖酸杆菌中的脱氢酶基因，所述脱氢酶基因包括编码l-艾杜糖酸-5-脱氢酶i5d、nad依赖型木糖醇脱氢酶nad-dependent xd2、乙醇脱氢酶ad4、醛酮脱氢酶asd、异柠檬酸脱氢酶id、nad(p)h脱氢酶nadh-d2、锌依赖型乙醇脱氢酶zinc-dependent ad和/或葡萄糖酸脱氢酶g2d的基因。

3、在一种实施方式中，所述编码l-艾杜糖酸-5-脱氢酶的基因的核苷酸序列如seqid no.1所示；所述编码nad依赖型木糖醇脱氢酶的基因的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述编码乙醇脱氢酶的基因的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述编码醛酮脱氢酶的基因的核苷酸序列如seq id no.4；所述编码异柠檬酸脱氢酶的基因的核苷酸序列如seq idno.5所示；所述编码nad(p)h脱氢酶的基因的核苷酸序列如seq id no.6所示；所述编码锌依赖型乙醇脱氢酶的基因的核苷酸序列如seq id no.7所示；所述编码葡萄糖酸脱氢酶的基因的核苷酸序列如seq id no.8所示。

4、在一种实施方式中，以g.oxydans wsh-003为宿主。

5、本发明的第二个目的是提供一种提高1,3-二羟基丙酮产量的方法，所述基因工程菌是敲除氧化葡萄糖酸杆菌中的脱氢酶基因，所述脱氢酶基因包括编码l-艾杜糖酸-5-脱氢酶i5d、nad依赖型木糖醇脱氢酶nad-dependent xd2、乙醇脱氢酶ad4、醛酮脱氢酶asd、异柠檬酸脱氢酶id、nad(p)h脱氢酶nadh-d2、锌依赖型乙醇脱氢酶zinc-dependent ad和/或葡萄糖酸脱氢酶g2d的基因。

6、在一种实施方式中，所述编码l-艾杜糖酸-5-脱氢酶的基因的核苷酸序列如seqid no.1所示；所述编码nad依赖型木糖醇脱氢酶的基因的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述编码乙醇脱氢酶的基因的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述编码醛酮脱氢酶的基因的核苷酸序列如seq id no.4；所述编码异柠檬酸脱氢酶的基因的核苷酸序列如seq idno.5所示；所述编码nad(p)h脱氢酶的基因的核苷酸序列如seq id no.6所示；所述编码锌依赖型乙醇脱氢酶的基因的核苷酸序列如seq id no.7所示；所述编码葡萄糖酸脱氢酶的基因的核苷酸序列如seq id no.8所示。

7、在一种实施方式中，所述氧化葡萄糖酸杆菌为g.oxydans wsh-003。

8、本发明的第三个目的是提供一种提高氧化葡萄糖酸杆菌1,3-二羟基丙酮生产强度的方法，其特征在于，敲除氧化葡萄糖酸杆菌中的脱氢酶基因；所述脱氢酶基因包括编码l-艾杜糖酸-5-脱氢酶、nad依赖型木糖醇脱氢酶、乙醇脱氢酶、醛酮脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、nad(p)h脱氢酶、锌依赖型乙醇脱氢酶和/或葡萄糖酸脱氢酶的基因。

9、在一种实施方式中，所述编码l-艾杜糖酸-5-脱氢酶的基因的核苷酸序列如seqid no.1所示；所述编码nad依赖型木糖醇脱氢酶的基因的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述编码乙醇脱氢酶的基因的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述编码醛酮脱氢酶的基因的核苷酸序列如seq id no.4；所述编码异柠檬酸脱氢酶的基因的核苷酸序列如seq idno.5所示；所述编码nad(p)h脱氢酶的基因的核苷酸序列如seq id no.6所示；所述编码锌依赖型乙醇脱氢酶的基因的核苷酸序列如seq id no.7所示；所述编码葡萄糖酸脱氢酶的基因的核苷酸序列如seq id no.8所示。

10、在一种实施方式中，所述氧化葡萄糖酸杆菌为g.oxydanswsh-003。

11、本发明的第四个目的是提供一种生产1,3-二羟基丙酮的方法，所述方法是利用所述基因工程菌，转化生产1,3-二羟基丙酮。

12、在一种实施方式中，将所述基因工程菌的种子液加入反应体系中，在在25-35℃，200-250rpm条件下反应，反应时间不少于60h。

13、在一种实施方式中，反应体系中含有甘油100g·l-1、酵母粉15-30g·l-1、caco35.0g·l-1、mgso4·7h2o 1g·l-1、(nh4)2so4 2g·l-1、k2hpo4·3h2o 0.131g·l-1、kh2po40.9g·l-1，ph为6.2。

14、本发明还提供了所述基因工程菌在生产1,3-二羟基丙酮中的应用。

15、本发明的有益效果：

16、本发明方法可提高1,3-二羟基丙酮产量、转化率及生产强度。与对照菌株g.oxydanswsh-003相比，重组菌株g.oxydans wsh-1、g.oxydans wsh-2、g.oxydans wsh-3、g.oxydans wsh-4、g.oxydans wsh-5、g.oxydans wsh-6、g.oxydans wsh-7和g.oxydanswsh-8的1,3-二羟基丙酮产量(g·l-1)分别提高了16.36、18.42、26.59、21.00、15.08、17.48、16.88、16.49；转化率(％)分别提高了16.36、18.42、26.59、21.00、15.08、17.48、16.88、16.49；生产强度(g·l-1·h-1)分别提高了0.23、0.26、0.37、0.29、0.21、0.24、0.23、0.23。