一种核酸检测试剂及其制备方法与流程

本发明涉及分子诊断、生物医药，具体属于一种核酸检测试剂及其制备方法。

背景技术：

1、pcr，已经成为生命研究领域的基础技术之一, 基于普通pcr技术开发的荧光pcr技术等，发达国家在相关方法和仪器方面的研发非常快，但，核酸检测试剂，世界各国都是以半成品（大包装）为主，需现配现用，不能反复冻融，不可长时间暴露在光线下，有条件的应远离同栋实验室进行加工分装，终端使用限制多。

2、传统成品制作工艺复杂繁锁费时，人工制作时稳定性差，难以量产，现实中，大部分企业不具备制作成品（单人份单管，即用型）的能力，缺少成品核心原料，缺少自动化设备无法规模化（百万级日产量）生产。

3、疾控中心、医疗机构、科研团队、第三方检验机构等等，只能被动使用核酸检测试剂（半成品）,在实验室进行试剂配制过程中，移液器、容器、水及其他溶液被核酸污染的概率大增,扩增产物蒸发形成的气溶胶，污染影响不容忽视，扩增产物拷贝量大，远远高于核酸检测数个拷贝的极限，极微量的扩增产物污染就可形成假阳性，同时蒸发形成的气溶胶，导致体系的体积稳定性差和透光性下降，从而影响扩增效果。这类污染危害对于pcr技术类的实验结果尤其显著，一旦形成气溶胶污染，则可引起整个pcr实验室污染，甚至需要关闭实验室。

4、此外，虽然也有尝试将试剂成分封装在同一容器中技术研究，如公开号为cn113736868a的一种rna类核酸检测试剂保存方法及试剂盒以及使用方法，该技术方案中实现了试剂装配在同一容器中，但是方案中的石蜡片可理解为固态，安装难度大，存在操作时石蜡片易破损，放置到预定目标位置非常难，也难以实现较好的密封效果，而且技术方案中第一混合物与第二混合物之间的石蜡片的熔点温度36-38摄氏度，第二混合物与第三混合之间的石蜡片的熔点温度48-52摄氏度，加热需耗时，工艺复杂繁锁费时，实施时难度非常高，还需要特配的容器，无法直接在pcr中使用，并不实用。

技术实现思路

1、针对背景技术中存在的缺陷和不足，本发明提供了一种核酸检测试剂，能够闭管封装，不需要使用时再调配，检测时可避免扩增产物引起的污染，且操作简便。

2、本发明的目的之二是提供一种核酸检测试剂的制备方法，能够将检测试剂的各组份闭管封装，不需要使用时再调配，检测时可避免扩增产物引起的污染，且制备方法简便，操作难度低。

3、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

4、一种核酸检测试剂，包括反应管、试剂组份和成品原材料，

5、所述试剂组份包括ac相和b相，所述ac相的成分包括特异性引物、探针、缓冲液、dntps、mg2+预混液；所述b相的成分包括热启动taq抗体酶、taq酶预混液；

6、所述ac相与b相之间铺设成品原材料，并通过成品原材料分隔形成不同的预叠层封装于反应管中；

7、所述成品原材料的成分包括蜡、石蜡油、凡士林中的一种或者多种；

8、所述ac相和b相的液化温度均低于所述成品原材料的液化温度，从而再保持ac相和b相的呈液态，并低于成品原材料的液化温度时，加入成品原材料，从而利用利用温差时差瞬间凝固，从而不影响扩增效果，更易实施。

9、该技术方案获得的成品使用前进行离心后，即可进行检测，无需调配，检测时可避免扩增产物引起的污染。

10、进一步所采取的措施是：所述ac相包括a相和c相；所述c相中的成分包括特异性引物、探针预混液；所述b相中的成分包括缓冲液、dntps、mg2+预混液；

11、所述所述a相与c相之间铺设成品原材料，并通过成品原材料分隔形成不同的预叠层封装于反应管中；

12、所述a相、c相的液化温度均低于所述成品原材料的液化温度。

13、进一步所采取的措施是：所述试剂组份的顶部铺设有成品原材料，并通过所述成品原材料形成的预叠层将所述试剂组份封装在反应管底部。

14、通过试剂组份的顶部铺设有成品原材料，该技术方案获得的成品使用前无需进行离心，即可进行检测，更加方便快捷，检测时可避免扩增产物引起的污染。

15、进一步所采取的措施是：所述a相中缓冲液为三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液。

16、进一步所采取的措施是：所述b相中的成分还包括ung酶、rnasin、逆转录酶的预混酶液。

17、进一步所采取的措施是：所述反应管为单连管或者多联pcr管。

18、一种核酸检测试剂的制备方法，其特征在于：所述核酸检测试剂包括反应管、试剂组份和成品原材料，包括以下步骤：

19、取ac相的成分进行液化、混匀，保存，得到ac相预混液；

20、取b相成分进行液化混匀、低温保存，得到b相预混液；

21、取成品原材料成分，进行液化保存，备用；

22、取干净的反应管，备用；

23、接下来，在大于等于预混液液化温度且低于成品原材料液化温度的环境下，在反应管中加入ac预混液相或b相预混液，然后迅速加入液态成品原材料，利用温差时差形成预叠层进行封装，再加入剩余的另一组预混液，将ac相与b分隔封装于反应管中，制作得到成品。

24、进一步所采取的措施是：所述ac相包括a相和c相；所述c相中的成分包括特异性引物、探针预混液；所述b相中的成分包括缓冲液、dntps、mg2+预混液；所述ac相的添加包括以下步骤：取a相、c相的成分分开进行液化、混匀，保存，得到a相预混液、c相预混液；在反应管中加入a相预混液或c相预混液中的一种，然后迅速加入液态成品原材料，利用温差时差形成预叠层进行封装，再加入剩余的另一组预混液，进而将a相预混液与c相预混液分隔封装于反应管中。

25、进一步所采取的措施是：所述ac相预混液、b相预混液均通过成品原材料分隔封装于反应管中后，在最顶层预混液上再铺设一层成品原材料，并通过成品原材料将各组预混业封装于反应管中，

26、进一步所采取的措施是：所述ac相进行液化、混匀后，保存温度为4℃±1；

27、所述b相进行液化混匀后，保存温度为-20℃±5；

28、所述成品原材料进行液化后，保存温度为32℃±3；

29、并在4℃-25℃环境下，将各组预混液及成品原材料按照相应步骤加入反应管中，进行封装，制作得到成品。

30、本发明从保障核酸检测试剂三大重要指标：特异性、灵敏度、稳定性的角度出发，采用核酸成品解决方案，提供一种核酸检测试剂成品制作新工艺,适用于pcr类的核酸检测试剂，通过试剂成分的科学合理搭配，以及操作方法路径的巧妙设计和无数试验验证，本技术方案能够实现核酸检测试剂所有组分预叠层封装在同一管中，可免去终端检测人员使用时复杂的体系配制过程，同时成品能够低温环境下实现较长时间保存及运输，如试剂保存于一20±5℃，可保持稳定达到 12～14个月。

31、本发明成品制作过程精简，操作难度低，能够减少不必要的核酸检测试剂组分反复冻融，减少暴露在光线下时间，避免酶与引物、探针之间提前预混保存；需要注意的是，为保持酶的活性低温状态不凝固，本发明b相多种酶的预混液的液化保存温度比较低，例如在4℃-25℃环境下也需呈液态，预混液中可以添加如甘油类，能有效阻止凝固，低温酶的活性只是暂时降低或者消失，酶的分子结构并没有破坏，也就是没有失活，成品制作，以不降低性能为前提，利用温差时差瞬间凝固，从而不影响扩增效果，实现核酸检测试剂所有组分预叠层封装在同一管中。

32、例如可以采用试剂a相、c相混匀保存温度为4℃±1，容器内的b相混匀保存温度为-20℃±5，容器内的核心成品原材料液化保存温度为32℃±3，由液态加入，利用温差时差瞬间凝固，从而不影响扩增效果，更易实施。整个技术方案工艺简洁先进，反应管通用耗材适用范围广，同时基于技术局限，以不降低性能为前提，核酸检测试剂成品制作新工艺，成品制作原理科学，易于实施，工艺简洁先进，制作的成品特异性强、灵敏度高、稳定性好，符合预期，符合要求。

33、而且本发明采用易配套自动设备制作成品，pcr反应管通用耗材适用范围广,与仪器适配度高，兼容好。

34、通过上述技术方案，本发明与现有技术相比，所具有的有益效果如下：

35、（1）快速：直接加入处理好的核酸样本即可检测；（2）准确：推荐方法结果符合率100%；（3）简便：所有组分叠层封装在同一管中，开盖即用型，操作简单，保存便捷；（4）可靠：特异性强,灵敏度更高，稳定性更好；（5）无污染：闭管封装，检测时可避免扩增产物引起的污染；（6）减少使用操作步骤，提高试剂稳定性和试剂灵敏度，避免了配制试剂污染。

36、此外，本发明适用于任何一种pcr扩增试剂的制作，适用性广；能够减少操作步骤、提高试剂稳定性、提高试剂灵敏度，提高了临床pcr检测结果的可靠性；免去终端使用时复杂的体系配制过程，操作人员节省时间，减少漏检和错检。