5`-UTR序列及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术和核酸药物领域，具体地，涉及能够提高蛋白编码区翻译效率的5`-utr序列及其应用。

背景技术：

1、基于mrna的治疗方法，在实际应用中较为精准且可用于个体化治疗，因此是现代医学发展的新方向。与哺乳动物细胞系中表达的重组蛋白相比，mrna的生产更快、更灵活。在过去十年中，mrna修饰和递送系统领域的技术发展迅速推进了mrna疫苗的基础和临床研究。然而，mrna疗法面临的技术问题也很明显，比如mrna在体内表达效率低等问题，mrna疫苗的保护效力并不乐观，这些也是临床应用亟需优化的关键问题。

2、基于稳定性和蛋白翻译效率而优化开发的mrna，可以最大限度地提高mrna生产及避免递送中的损失问题。5`utr在mrna翻译过程中至关重要，包括核糖体募集、扫描和起始密码子选择。5`utr序列长度一般在100-200核苷酸。carsten rudolph等在一项研究中比较了5个不同的utr序列对于mrna稳定性和翻译效率的影响，结果显示人细胞cybautr序列可以在不影响rna半衰期的情况下增强翻译效率。有发现双拷贝beta globin 3`-utr序列在树突细胞中支持蛋白的高效表达。在过往研究中使用到的utr序列包括：来自cmv(cytomegalovirus，人类巨噬细胞病毒)的增强子序列，人alpha-globin(α-珠蛋白)5`utr、人生长激素utr序列、非洲爪蟾蜍beta-globin(β-珠蛋白)utr等。utr对于mrna翻译效率的影响不仅与细胞类型有关，而且高度依赖二级结构。相对较短的设计utr能更好的完成预设目的，设计出最短的utr序列是非常有必要的，既可以免受细胞类型差异的影响，又能够在插入修饰核苷酸时使其对翻译效率的影响降至最弱。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供能够提高蛋白编码区翻译效率的5`-utr序列及其在制备mrna药物中的应用。

2、本发明的第一方面，提供了一种5`-utr元件，所述5`-utr元件用于构建mrna转录模板，提高所述mrna转录模板转录得到的mrna中编码区的翻译效率，所述5`-utr元件的核苷酸序列选自下组：

3、(a)如seq id no:1-4中任一项所示的核苷酸序列；

4、(b)与seq id no:1-4中任一项所示序列的同源性≥70％(较佳地≥80％，更佳地≥90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％)，且具有提高mrna中编码区翻译效率活性的核苷酸序列；或

5、(c)如seq id no:1-4中任一项所示核苷酸序列的5`端和/或3`端增加和/或减少1-50个(较佳地1-30，更佳地1-10个，更佳地1-5个)核苷酸，且具有提高mrna中编码区翻译效率活性的核苷酸序列。

6、在另一优选例中，所述5`-utr元件的长度为20-100nt，较佳地25-90nt。

7、在另一优选例中，所述5`-utr元件为mdm2基因的5`-utr。

8、在另一优选例中，所述5`-utr元件的核苷酸序列为mdm2基因的5`-utr的野生型序列，如seq id no:1所示。

9、在另一优选例中，所述5`-utr元件的核苷酸序列为mdm2基因的5`-utr的人工改造序列。

10、在另一优选例中，所述mdm2基因的5`-utr序列的人工改造序列如seq id no:2所示。

11、在另一优选例中，所述5`-utr元件的核苷酸序列为与seq id no:1或2所示序列的同源性≥70％(较佳地≥80％，更佳地≥90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％)，且具有提高mrna中编码区翻译效率活性的核苷酸序列。

12、在另一优选例中，所述5`-utr元件的核苷酸序列为如seq id no:1或2所示核苷酸序列的5`端和/或3`端增加和/或减少1-50个(较佳地1-30，更佳地1-10个，更佳地1-5个)核苷酸，且具有提高mrna中编码区翻译效率活性的核苷酸序列。

13、在另一优选例中，所述5`-utr元件为p16基因的5`-utr。

14、在另一优选例中，所述5`-utr元件的核苷酸序列为p16基因的5`-utr的野生型序列，如seq id no:3所示。

15、在另一优选例中，所述5`-utr元件的核苷酸序列为p16基因的5`-utr的人工改造序列。

16、在另一优选例中，所述p16基因的5`-utr序列的人工改造序列如seq id no:4所示。

17、在另一优选例中，所述5`-utr元件的核苷酸序列为与seq id no:3或4所示序列的同源性≥70％(较佳地≥80％，更佳地≥90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％)，且具有提高mrna中编码区翻译效率活性的核苷酸序列。

18、在另一优选例中，所述5`-utr元件的核苷酸序列为如seq id no:3或4所示核苷酸序列的5`端和/或3`端增加和/或减少1-50个(较佳地1-30，更佳地1-10个，更佳地1-5个)核苷酸，且具有提高mrna中编码区翻译效率活性的核苷酸序列。

19、在另一优选例中，所述5`-utr元件含有用于增强翻译活性的序列元件。

20、在另一优选例中，所述用于增强翻译活性的序列元件具有如seq id no:12(gccacc)所示的核苷酸序列。

21、本发明的第二方面，提供了一种mrna转录模板构建体，所述构建体具有式i结构：

22、z1-z2-z3-z4-z5-z6-z7                 (i)

23、式中，

24、z1、z7为无或酶切位点；

25、z2为无或启动子元件或无核糖体入核位点序列(ires)；

26、z3为本发明第一方面所述的5`-utr元件；

27、z4为可替换的编码区；

28、z5为3`-utr元件；

29、z6为无或polya尾部元件。

30、在另一优选例中，所述z1、z6为平末端酶切位点或粘性末端酶切位点。

31、在另一优选例中，所述mrna转录模板构建体包括酶切位点、启动子元件、5`-utr元件、可替换的编码区和3`-utr。

32、在另一优选例中，所述z2为启动子，所述启动子选自下组：t7启动子、t3启动子、sp6启动子、cag启动子、ubc启动子、cmv启动子、u6启动子、ef1a启动子、pgk1启动子、tre启动子、ac5启动子、uas启动子、sv40启动子、adh1启动子、camv35s启动子、ubi启动子、lac启动子、ptac启动子、pl启动子，或其组合。

33、在另一优选例中，所述z3选自下组：如seq id no:1-4中任一项所示的核苷酸序列。

34、在另一优选例中，所述z3具有如seq id no:2或3所示的核苷酸序列，优选地，具有如seq id no:2所示的核苷酸序列。

35、在另一优选例中，所述z4为用于预防和/或治疗传染性疾病、罕见遗传病、神经退行性疾病、视网膜病变、癌症或肿瘤的蛋白编码基因。

36、在另一优选例中，所述z4选自下组：病原体抗原基因、基因组中的转座子(包括沉默和活跃转座子)、细胞因子、生长因子、蛋白激素、多肽激素、肿瘤相关抗原(taa)、肿瘤特异性抗原(tsa)、通用肿瘤突变位点抗原、蛋白佐剂、多肽佐剂、核酸佐剂，或其组合。

37、在另一优选例中，所述z5与z3来源于同一转录本。

38、在另一优选例中，所述z5与z3来源于不同转录本。

39、在另一优选例中，所述z5的核苷酸序列如seq id no:11所示。

40、本发明的第三方面，提供了一种载体，所述载体含有如本发明第二方面所述的mrna转录模板构建体。

41、在另一优选例中，所述载体选自下组：dna、rna、病毒载体、质粒、转座子、其他基因转移系统，或其组合；优选地，所述载体为质粒。

42、本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如本发明第三方面所述的载体。

43、在另一优选例中，所述的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。

44、在另一优选例中，所述的宿主细胞选自下组：大肠杆菌、酵母细胞、哺乳动物细胞。

45、本发明的第五方面，提供了一种产生用于制备mrna药物的优化mrna的方法，所述方法包括步骤：

46、(i)在适合的条件下，培养如本发明第四方面所述的宿主细胞，从而获得含有mrna转录模板构建体的载体的培养物；

47、(ii)从所述培养物中分离和/或回收(i)中所述载体，并酶切线性化为mrna转录模板；

48、(iii)将(ii)中所述mrna转录模板进行转录，从而获得所述优化mrna；和

49、(iv)任选地，对步骤(iii)获得的优化mrna进行纯化和/或修饰。

50、本发明的第六方面，提供了一种优化mrna，所述优化mrna是用如本发明第五方面所述的方法制备得到的，并且所述优化mrna具有式ii所示结构：

51、m1-m2-m3-m4-m5-m6     (ii)

52、式中，

53、m1为5`端帽子元件；

54、m2为无或无核糖体入核位点序列(ires)；

55、m3为本发明第一方面所述的5`-utr元件；

56、m4为可替换的编码区；

57、m5为3`-utr元件；

58、m5为polya尾部元件。

59、在另一优选例中，所述m3选自下组：具有如seq id no:1-4中任一项所示的核苷酸序列的5`-utr元件。

60、在另一优选例中，所述m3为具有如seq id no:2或3所示的核苷酸序列的5`-utr元件，优选地，具有如seq id no:2所示的核苷酸序列的5`-utr元件。

61、在另一优选例中，所述m4为用于预防和/或治疗传染性疾病、罕见遗传病、神经退行性疾病、视网膜病变、癌症或肿瘤的蛋白编码基因。

62、在另一优选例中，所述m4选自下组：病原体抗原基因、基因组中的转座子(包括沉默和活跃转座子)、细胞因子、生长因子、蛋白激素、多肽激素、肿瘤相关抗原(taa)、肿瘤特异性抗原(tsa)、通用肿瘤突变位点抗原、蛋白佐剂、多肽佐剂、核酸佐剂，或其组合。

63、在另一优选例中，所述m5与m3来源于同一转录本。

64、在另一优选例中，所述m5与m3来源于不同转录本。

65、在另一优选例中，所述m5具有如seq id no:11所示的核苷酸序列。

66、在另一优选例中，所述m6的长度较佳地为100nt-150nt，更佳地为110nt-130nt，最佳地为120nt。

67、在另一优选例中，所述m6的序列如seq id no:10所示。

68、本发明的第七方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含：

69、(c1)如本发明第二方面所述的mrna转录模板构建体，或如本发明第六方面所述的优化mrna作为活性成分；和

70、(c2)药学上可接受的载体。

71、在另一优选例中，所述药物组合物为疫苗组合物。

72、在另一优选例中，所述药物组合物的剂型选自下组：注射剂、冻干剂、雾化吸入剂、涂抹式药剂。

73、在另一优选例中，所述药物组合物通过注射施用，即静脉内、肌内、皮内、皮下、鞘内、十二指肠内或腹膜内注射。

74、在另一优选例中，所述药物组合物通过吸入施用，例如鼻内施用。

75、在另一优选例中，所述药物组合物经皮施用，例如经皮涂抹施用或电极导入给药。

76、在另一优选例中，所述药物组合物是将所述mrna用阳离子脂进行包裹所形成的脂质纳米颗粒，即lnp-mrna。

77、在另一优选例中，所述疫苗组合物包括0.01～99.99％的如本发明第六方面所述的优化mrna和0.01～99.99％的药学上可接受的载体，所述百分比为占所述疫苗组合物的质量百分比。

78、在另一优选例中，所述药物组合物用于制备预防和/或治疗包括(但不限于)传染性疾病、罕见遗传病、神经退行性疾病、视网膜病变、癌症或肿瘤的药物。

79、在另一优选例中，所述传染性疾病包括(但不限于)以下疾病或由以下病原体引起的疾病：肉毒杆菌毒素、水蛭素、巨细胞病毒(cmv)、寨卡病毒(zika)、流感病毒(influenza)、呼吸道合胞病毒(rsv)、基孔肯雅病(chikungunya)、狂犬病(rabies)、艾滋病毒(hiv)、埃博拉病毒(ebola virus)、链球菌(streptococci)、疟疾(malaria)、跳跃病病毒(louping ill virus)、岗地弓形虫(toxoplasma gondii)、登革热、鼠疫、黄热病、结核病、单纯疱疹病毒、带状病毒、支原体、衣原体、口蹄疫病毒、轮状病毒、水痘病毒、乳头瘤病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、鼻病毒、手足口病病毒、风疹病毒、麻疹病毒、博纳病病毒、逆转录病毒(t淋巴细胞病毒)、尼帕病毒、多瘤病毒、绿脓杆菌、sars-cov-2、sars、mers、hbv、ebv、猴痘、天花、念珠菌、李斯特菌、甲病毒属下所有病毒(奥拉病毒(aura virus)，巴马森林病毒(barmah forest virus)，比巴鲁病毒(bebaru virus)，caaingua virus，卡巴斯欧病毒(cabassou virus)，基孔肯雅病毒(chikungunya virus)，东部马脑炎病毒(easternequine encephalitis virus)，艾拉特病毒(eilat virus)，沼泽地病毒(evergladesvirus)，摩根堡病毒(fort morgan virus)，盖塔病毒(getah virus)，高地j病毒(highlands j virus)，madariaga virus，玛雅罗病毒(mayaro virus)，米德尔堡病毒(middelburg virus)，莫斯达斯佩德拉斯病毒(mosso das pedras virus)，mucambovirus，恩杜穆病毒(ndumu virus)，o`nyong`nyong virus，pixuna virus，里约热内卢病毒(rio negro virus)，罗斯河病毒(ross river virus)，鲑鱼胰腺病病毒(salmon pancreasdisease virus)，西门里克森林病毒(semliki forest virus)，辛德毕斯病毒(sindbisvirus)，南方象海豹病毒(southern elephant seal virus)，图纳特病毒(tonate virus)，特洛卡拉病毒(trocara virus)，乌纳病毒(una virus)，委内瑞拉马脑炎病毒(venezuelanequine encephalitis virus)，西部马脑炎病毒(western equine encephalitis virus)，瓦塔罗阿病毒(whataroa virus)、丙肝、甲肝。

80、在另一优选例中，所述药物组合物用于制备预防和/或治疗包括(但不限于)选自下组的罕见遗传病的药物：肌萎缩侧索硬化，angelman氏症候群(天使综合征)，精氨酸酶缺乏症，生物素酶缺乏症，先天性肌无力综合征，法布雷病，戈谢病，血友病，亨廷顿舞蹈病，leber遗传性视神经病变，多发性硬化，帕金森病，肺囊性纤维化，镰刀型细胞贫血病，脊髓性肌萎缩症。

81、在另一优选例中，所述药物组合物还可以用于制备：所有过继细胞治疗药物、所有基因编辑(talen,crispr,zfn)&基因治疗mrna替代方案(替代物料/原料中的蛋白制品、dna、病毒颗粒、或其他核酸蛋白制品)、畜牧动物疫苗、宠物疫苗等。

82、本发明的第八方面，提供了一种mrna药物组合物的制备方法，所述方法包括：将如本发明第六方面所述的优化mrna与药学上可接受的载体混合，从而获得所述mrna药物组合物。

83、在另一优选例中，所述mrna药物组合物为mrna疫苗组合物。

84、本发明的第九方面，提供了一种如本发明第一方面所述的5`-utr元件的用途，用于构建mrna转录模板，从而提高所述mrna转录模板转录得到的mrna中编码区的翻译效率。

85、本发明的第十方面，一种如本发明第六方面所述的优化mrna或如本发明第七方面所述的药物组合物的用途，用于制备一药物，所述药物用于预防和/或治疗传染性疾病、罕见遗传病、神经退行性疾病、视网膜病变、癌症或肿瘤。

86、在另一优选例中，所述传染性疾病包括(但不限于)以下疾病或由以下病原体引起的疾病：肉毒杆菌毒素、水蛭素、巨细胞病毒(cmv)、寨卡病毒(zika)、流感病毒(influenza)、呼吸道合胞病毒(rsv)、基孔肯雅病(chikungunya)、狂犬病(rabies)、艾滋病毒(hiv)、埃博拉病毒(ebola virus)、链球菌(streptococci)、疟疾(malaria)、跳跃病病毒(louping ill virus)、岗地弓形虫(toxoplasma gondii)、登革热、鼠疫、黄热病、结核病、单纯疱疹病毒、带状病毒、支原体、衣原体、口蹄疫病毒、轮状病毒、水痘病毒、乳头瘤病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、鼻病毒、手足口病病毒、风疹病毒、麻疹病毒、博纳病病毒、逆转录病毒(t淋巴细胞病毒)、尼帕病毒、多瘤病毒、绿脓杆菌、sars-cov-2、sars、mers、hbv、ebv、猴痘、天花、念珠菌、李斯特菌、甲病毒属下所有病毒(奥拉病毒(aura virus)，巴马森林病毒(barmah forest virus)，比巴鲁病毒(bebaru virus)，caaingua virus，卡巴斯欧病毒(cabassou virus)，基孔肯雅病毒(chikungunya virus)，东部马脑炎病毒(easternequine encephalitis virus)，艾拉特病毒(eilat virus)，沼泽地病毒(evergladesvirus)，摩根堡病毒(fort morgan virus)，盖塔病毒(getah virus)，高地j病毒(highlands j virus)，madariaga virus，玛雅罗病毒(mayaro virus)，米德尔堡病毒(middelburg virus)，莫斯达斯佩德拉斯病毒(mosso das pedras virus)，mucambovirus，恩杜穆病毒(ndumu virus)，o`nyong`nyong virus，pixuna virus，里约热内卢病毒(rio negro virus)，罗斯河病毒(ross river virus)，鲑鱼胰腺病病毒(salmon pancreasdisease virus)，西门里克森林病毒(semliki forest virus)，辛德毕斯病毒(sindbisvirus)，南方象海豹病毒(southern elephant seal virus)，图纳特病毒(tonate virus)，特洛卡拉病毒(trocara virus)，乌纳病毒(una virus)，委内瑞拉马脑炎病毒(venezuelanequine encephalitis virus)，西部马脑炎病毒(western equine encephalitis virus)，瓦塔罗阿病毒(whataroa virus)、丙肝、甲肝。

87、在另一优选例中，所述罕见遗传病选自下组：肌萎缩侧索硬化，angelman氏症候群(天使综合征)，精氨酸酶缺乏症，生物素酶缺乏症，先天性肌无力综合征，法布雷病，戈谢病，血友病，亨廷顿舞蹈病，leber遗传性视神经病变，多发性硬化，帕金森病，肺囊性纤维化，镰刀型细胞贫血病，脊髓性肌萎缩症。

88、应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。