一种生产樟脑的冰片脱氢酶基因的序列、表达及其应用

1.本发明涉及药用植物分子生物学和基因工程技术领域，更具体地说是涉及艾冰片脱氢酶aarbdh4蛋白、编码基因及应用。


背景技术：

2.艾叶artemisiae argyi folium为菊科蒿属植物艾artemisia argyi l
é
vl.et vant.的干燥叶，其性辛、温，味苦，归肝、脾、肾经，具有温经止血、散寒止痛的功效，主要治疗吐血、衄血、崩漏、月经过多、胎漏下血、少腹冷痛、经寒不调、宫冷不孕等疾病，外用可以祛湿止痒。艾叶晒干捣碎得“艾绒”，可制艾条，供艾灸用。现代研究发现挥发油是艾的主要药效物质基础，具有广谱抗菌性、抗氧化、抗炎、抗肿瘤、镇痛、平喘、免疫调节等能力，其主要成分为单萜类、倍半萜类化合物及其衍生物。
3.单萜类化合物樟脑是艾叶挥发油的重要组分之一，室温下为白色或透明的固体，易升华，具有独特的香气。樟脑具有通关窍、利滞气、辟秽浊、杀虫止痒、消肿止痛的功效，主治疥癣瘙痒、跌打伤痛、牙痛等症状。目前市面上使用的樟脑多数是通过化学合成的方式获得的，但在医药等方面的特殊用途中化学合成樟脑很难完全代替天然樟脑。化学合成樟脑或从植物中提取天然樟脑面临着材料难以获得、步骤繁琐、环境污染等问题，因此利用生物工程技术，建立微生物工厂合成天然樟脑，具有极大的应用前景。
4.先前的研究报道，属于短链脱氢酶/还原酶(short-chain dehydrogenases/reductases,sdr)家族的冰片脱氢酶bdh具有将龙脑催化为樟脑的功能。bdh在黄花蒿、樟树、艾纳香等少数物种中被克隆，但尚未发现从艾中可以得到具有合成樟脑功能的关键酶基因的相关研究。克隆艾中bdh并研究其功能有助于为艾叶药材品质的形成提供理论基础，同时为利用基因工程技术生产天然樟脑带来广阔的应用空间。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种高效合成樟脑的艾冰片脱氢酶aarbdh4蛋白、编码基因及应用。
6.本发明首先提供了一种蛋白，包括如下1)-3)所示：
7.1)seq id no.1所示的氨基酸序列；
8.2)与seq id no.1所示的序列具有相同功能，且通过取代缺失或增加一个或多个氨基酸而获得的序列；
9.3)与seq id no.1所示的蛋白质具有相同功能，且n端或c端连接标签得到的融合蛋白质。
10.上述蛋白质，蛋白标签是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签和/或sumo标签等。
11.还提供了一种编码权利要求1所述蛋白的编码基因，其中，所述编码基因为如下中
至少一种：
12.1)seq id no.2所示的核苷酸序列；
13.2)在严格条件下与1)限定的核苷酸序列杂交且编码权利要求1所述蛋白质的dna分子；
14.3)与1)或2)限定的核苷酸序列具有90％以上的同一性且编码权利要求1所述蛋白质的核苷酸序列；
15.4)由seq id no.2所示的序列通过取代、缺失或增加核苷酸而获得的序列；
16.5)由seq id no.2所示的核苷酸序列产生不同的转录本或者同源基因序列。
17.还提供了一种含有所述编码基因的重组载体、表达盒、重组菌、重组细胞、转基因植物。
18.基于艾全基因组及不同器官/组织转录组差异表达分析以及与已知功能的冰片脱氢酶bdh蛋白构建系统发育进化树分析，筛选出可能参与樟脑合成的bdh基因seq id no.2所示的核苷酸序列，或与所述的核苷酸序列与表达载体重组后导入到受体微生物中，表达载体具体为pet-28a，受体微生物具体为大肠杆菌bl21(de3)，得到表达aarbdh4蛋白质或与其具有相同功能的蛋白质的重组微生物，培养所述重组微生物，表达得到蛋白。
19.还提供了所述的编码基因在龙脑为底物下，催化生成樟脑的应用。
20.还提供了所述的重组载体、表达盒、重组菌、重组细胞、转基因植物在催化龙脑生长樟脑中的应用。
21.还提供了一种扩增所述编码基因的引物，所述引物如seq id no.3～seq id no.4所示。
22.还提供了一种制备所述的1)-3)蛋白质方法，所述方法包括：将所述编码基因的核苷酸序列与表达载体重组后导入到受体微生物中，得到重组菌株，培养所述重组菌株，表达得到所述的蛋白质。
23.还提供了一种制备樟脑的方法，所述方法包括用所述的1)-3)蛋白质催化龙脑生成樟脑，樟脑包括左旋樟脑或右旋樟脑。通过ni nta树脂纯化aarbdh4蛋白，在缓冲液中进行aarbdh4蛋白体外酶促反应，通过固相微萃取技术和气质联用(gc-ms)技术检测aarbdh4基因在原核表达体系体外的催化产物，获得催化产物樟脑。
24.本发明从艾中克隆得到aarbdh4即艾冰片脱氢酶，该基因是首次从艾中得到的重要指标性成分单萜类化合物龙脑合成的关键酶基因。通过实验证明本发明的aarbdh4能够催化龙脑形成樟脑，这对进一步解析艾中萜类化合物的合成具有重要作用，对进一步提高樟脑产量，增强药材品质具有重要意义。
附图说明
25.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
26.图1附图为艾候选bdh基因及其他已经鉴定的bdh基因系统发育进化树；
27.图2附图为候选bdh基因在不同组织部位中的表达量分析图；
28.图3附图为体外表达体系中gc-ms检测的催化产物；
29.图4附图为aarbdh4催化产物的质谱图，横坐标轴上端为标品离子峰，横坐标轴下端为产物离子峰。
具体实施方式
30.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
31.实施例1 aarbdh筛选
32.1)基于艾基因组信息以及已知bdh基因序列筛选具有潜在樟脑合成功能的aarbdh，共有8个基因可能具有潜在龙脑合成的重要功能，其氨基酸序列长度为791～882之间。
33.2)选取已鉴定功能的aabdh(kt070864)，aaadh2(gu253890),libdh(afv30207),zsd1(ab480831),ccbdh3(mn551096)和8个候选艾bdh基因，使用mega软件建立系统发育进化树。如图1所示。
34.3)采用rna-seq技术对艾根、茎、叶、花等不同器官中候选bdh基因进行表达谱分析。如图2所示。
35.实施例2 aarbdh4的基因克隆及其编码蛋白质序列
36.依据艾基因组中的aarbdh4序列设计引物，以艾叶片cdna为模板进行扩增，获得长度为821bp的核苷酸序列，如seq id no.1。根据全长cdna序列翻译后获得aarbdh4编码的氨基酸序列，如seq id no.2。
37.实施例3 aarbdh4的体外催化反应以及产物检测
38.1)选取bamh i/ecor i作为酶切位点，对pet-28a载体进行酶切，使用无缝克隆试剂盒将目的基因片段aarbdh4连接至酶切载体中，构建pet-28a-aarbdh4基因表达载体；
39.2)分别将pet-28a空载体(对照)和pet-28a-aarbdh4转化至bl21感受态细胞中，将转化细胞涂布于含有50mg/l kana(卡那霉素)的平板筛选阳性克隆。挑选单菌落接种于含相应抗生素的lb液体培养基中，培养过夜后，按1:100转接进行扩大培养，待菌液的od
600
达到0.6时，加入0.5mm的iptg，于16℃摇床中，避光诱导16h，转速为110r/min；
40.3)诱导后的菌液和pet-28a空载体菌液，7000rpm/min冷冻离心10min得到菌体沉淀，使用5ml细胞裂解液和2μl 50mg/ml蛋白酶抑制剂重悬菌体，低温下超声破碎菌体后，7000rpm/min冷冻离心3min得到样品上清蛋白和对照上清蛋白。
41.4)样品上清蛋白用结合缓冲液(20mm tis-hcl ph＝8.0，10mm imidazole，0.5m nacl)稀释，将其挂于ni nta上；用结合缓冲液洗脱杂蛋白后，用含有50、150、200、300、500mm imidazole的洗脱缓冲液梯度洗脱目的蛋白，通过sds-page电泳检测，得到最优imidazole洗脱浓度下的纯化蛋白aarbdh4。使用bca检测试剂盒测定纯化蛋白浓度。
42.5)aarbdh4体外酶活性的测定在含有10μg纯化蛋白质酶活性测定在500μl缓冲液中进行，该缓冲液含有10mm nad+、10μg酶和5μg右旋龙脑作为底物，在30℃下孵育1小时。利用gc-ms方法检测挥发性产物。
43.6)gc-ms检测结果：相对于对照蛋白(pet-28a空载体上清蛋白)，aarbdh4在右旋龙脑作为底物的体外酶促反应中出现单一产物右旋樟脑，如图3所示，质谱图如图4所示。说明aarbdh4在原核表达体系中具有底物特异性和产物专一性，表明aarbdh4有望开发为高效专一合成樟脑的功能蛋白。
44.本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
45.对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。