一种体外诱导ips细胞分化生成人肝实质细胞的方法
技术领域
1.本发明涉及干细胞定向分化培养技术领域，具体为一种体外诱导ips细胞分化生成人肝实质细胞的方法。
背景技术：
2.目前，对于肝功能衰竭(如肝坏死、肝硬化等)和肝脏相关的遗传性疾病的临床治疗尚无特效疗法和技术手段。原位肝移植是公认的治疗晚期肝病的有效治疗方法。但是，供体肝来源严重不足和移植排斥等问题限制这一治疗手段的广泛开展。因此，干细胞技术的兴起及其应用有望成为解决晚期肝衰的最有潜力的方法之一。
3.诱导多功能干细胞ips具有多向分化无限增殖的能力，在合适的诱导条件下，可以分化为三胚层来源的功能细胞。随着干细胞研究特别是分化机制研究的不断深入，利用ips细胞可以在体外无限扩增和多向分化潜能，通过定向诱导ips细胞分化为肝细胞，就可获得足够的肝细胞来源。如果能够通过获得病人的体细胞并建立与患者具有相同遗传背景的ips细胞系，诱导其分化为病人所需的肝细胞用于患者的肝细胞移植治疗，该方法获得的个性化肝细胞可以最大限度地避免或者降低由异体细胞移植导致的免疫排斥反应。因此，本方案旨在提供一种体外定向诱导ips细胞分化成人肝实质细胞的方法，以解决干细胞来源缺口大的问题。
技术实现要素：
4.针对上述情况，为弥补上述现有缺陷，本发明提供了一种基于定向诱导培养基的体外诱导ips细胞分化生成人肝实质细胞的方法。
5.本发明提供如下的技术方案：本发明提出的一种体外诱导ips细胞分化生成人肝实质细胞的方法，具体包括下列步骤：
6.(1)将人胚胎干细胞在分化培养基ⅰ上培养；
7.(2)将步骤(1)获得的细胞在分化培养基ⅱ上培养，分化形成定向内胚层细胞；
8.(3)将步骤(2)获得的细胞在分化培养基ⅲ上培养；
9.(4)将步骤(3)获得的细胞在分化培养基ⅳ上培养，分化形成肝祖细胞；
10.(5)将步骤(4)获得的细胞在分化培养基
ⅴ
上培养，分化得到肝样组织；
11.所述分化培养基ⅰ为在基础细胞培养基中添加活化素a和谷氨酰胺，所述活化素a的浓度为15-220ng/ml，所述谷氨酰胺的浓度为5-10ng/ml；
12.所述分化培养基ⅱ为在基础细胞培养基中添加活化素a、谷氨酰胺和和胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合补充液，所述活化素a的浓度为15-220ng/ml，所述谷氨酰胺的浓度为5-10ng/ml，所述胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合补充液的体积浓度为0.1％-0.8％；
13.所述分化培养基ⅲ为在基础细胞培养基中添加骨形态发生蛋白、人成纤维细胞生长因子和胎牛血清，所述骨形态发生蛋白的浓度为3-5ng/ml，所述人成纤维细胞生长因子的浓度为20-30ng/ml，所述胎牛血清的浓度为18-50ng/ml；
14.所述分化培养基ⅳ为在基础细胞培养基中添加肝细胞生长因子、chir-99021抑制剂和制瘤素m，所述肝细胞生长因子的浓度为15-50ng/ml，所述chir-99021抑制剂的浓度为10-35ng/ml，所述制瘤素m的浓度为5-40ng/ml；
15.所述分化培养基
ⅴ
是在分化培养基ⅳ的基础上添加抗坏血酸、胰岛素和地塞米松，所述抗坏血酸的质量浓度为0.05～0.2％，所述胰岛素的质量浓度为0.05～0.2％，所述地塞米松的浓度为0.5-12μm。
16.进一步地，所述人胚胎干细胞在分化培养基ⅰ上培养2～3天。
17.进一步地，所述步骤(1)获得的细胞在分化培养基ⅱ上培养2～3天。
18.进一步地，所述步骤(2)获得的细胞在分化培养基ⅲ上培养6～7天。
19.进一步地，所述步骤(3)获得的细胞在分化培养基ⅳ上培养6～7天。
20.进一步地，所述步骤(4)获得的细胞在分化培养基
ⅴ
上培养20～22天。
21.作为优选地，所述分化培养基ⅰ、分化培养基ⅱ、分化培养基ⅲ、分化培养基ⅳ和分化培养基
ⅴ
的ph均在7.2～7.6。
22.采用上述结构本发明取得的有益效果如下：本发明提出的一种体外诱导ips细胞分化生成人肝实质细胞的方法，通过多级分化培养基作为诱导基础，有效诱导ips细胞定向分化为肝实质细胞，具有极大的潜在临床应用价值，为干细胞移植，肝疾病治疗奠定了基础。
具体实施方式
23.下面将结合本发明的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
24.实施例1
25.一种体外诱导ips细胞分化生成人肝实质细胞的方法，具体包括下列步骤：
26.(1)将人胚胎干细胞在分化培养基ⅰ上培养，所述分化培养基ⅰ为在基础细胞培养基中添加活化素a和谷氨酰胺，所述活化素a的浓度为15-220ng/ml，所述谷氨酰胺的浓度为5-10ng/ml，所述人胚胎干细胞在分化培养基ⅰ上培养2天；
27.(2)将步骤(1)获得的细胞在分化培养基ⅱ上培养，分化形成定向内胚层细胞，所述分化培养基ⅱ为在基础细胞培养基中添加活化素a、谷氨酰胺和和胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合补充液，所述活化素a的浓度为15-220ng/ml，所述谷氨酰胺的浓度为5-10ng/ml，所述胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合补充液的体积浓度为0.1％-0.8％，所述步骤(1)获得的细胞在分化培养基ⅱ上培养2天；
28.(3)将步骤(2)获得的细胞在分化培养基ⅲ上培养，所述分化培养基ⅲ为在基础细胞培养基中添加骨形态发生蛋白、人成纤维细胞生长因子和胎牛血清，所述骨形态发生蛋白的浓度为3-5ng/ml，所述人成纤维细胞生长因子的浓度为20-30ng/ml，所述胎牛血清的浓度为18-50ng/ml，所述步骤(2)获得的细胞在分化培养基ⅲ上培养6天；
29.(4)将步骤(3)获得的细胞在分化培养基ⅳ上培养，分化形成肝祖细胞，所述分化培养基ⅳ为在基础细胞培养基中添加肝细胞生长因子、chir-99021抑制剂和制瘤素m，所述
肝细胞生长因子的浓度为15-50ng/ml，所述chir-99021抑制剂的浓度为10-35ng/ml，所述制瘤素m的浓度为5-40ng/ml，所述步骤(3)获得的细胞在分化培养基ⅳ上培养6天；
30.(5)将步骤(4)获得的细胞在分化培养基
ⅴ
上培养，分化得到肝样组织，所述分化培养基
ⅴ
是在分化培养基ⅳ的基础上添加抗坏血酸、胰岛素和地塞米松，所述抗坏血酸的质量浓度为0.05～0.2％，所述胰岛素的质量浓度为0.05～0.2％，所述地塞米松的浓度为0.5-12μm，所述步骤(4)获得的细胞在分化培养基
ⅴ
上培养20天。
31.作为优选地，所述分化培养基ⅰ、分化培养基ⅱ、分化培养基ⅲ、分化培养基ⅳ和分化培养基
ⅴ
的ph均在7.2～7.6。
32.实施例2
33.一种体外诱导ips细胞分化生成人肝实质细胞的方法，具体包括下列步骤：
34.(1)将人胚胎干细胞在分化培养基ⅰ上培养，所述分化培养基ⅰ为在基础细胞培养基中添加活化素a和谷氨酰胺，所述活化素a的浓度为15-220ng/ml，所述谷氨酰胺的浓度为5-10ng/ml，所述人胚胎干细胞在分化培养基ⅰ上培养3天；
35.(2)将步骤(1)获得的细胞在分化培养基ⅱ上培养，分化形成定向内胚层细胞，所述分化培养基ⅱ为在基础细胞培养基中添加活化素a、谷氨酰胺和和胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合补充液，所述活化素a的浓度为15-220ng/ml，所述谷氨酰胺的浓度为5-10ng/ml，所述胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合补充液的体积浓度为0.1％-0.8％，所述步骤(1)获得的细胞在分化培养基ⅱ上培养3天；
36.(3)将步骤(2)获得的细胞在分化培养基ⅲ上培养，所述分化培养基ⅲ为在基础细胞培养基中添加骨形态发生蛋白、人成纤维细胞生长因子和胎牛血清，所述骨形态发生蛋白的浓度为3-5ng/ml，所述人成纤维细胞生长因子的浓度为20-30ng/ml，所述胎牛血清的浓度为18-50ng/ml，所述步骤(2)获得的细胞在分化培养基ⅲ上培养7天；
37.(4)将步骤(3)获得的细胞在分化培养基ⅳ上培养，分化形成肝祖细胞，所述分化培养基ⅳ为在基础细胞培养基中添加肝细胞生长因子、chir-99021抑制剂和制瘤素m，所述肝细胞生长因子的浓度为15-50ng/ml，所述chir-99021抑制剂的浓度为10-35ng/ml，所述制瘤素m的浓度为5-40ng/ml，所述步骤(3)获得的细胞在分化培养基ⅳ上培养7天；
38.(5)将步骤(4)获得的细胞在分化培养基
ⅴ
上培养，分化得到肝样组织，所述分化培养基
ⅴ
是在分化培养基ⅳ的基础上添加抗坏血酸、胰岛素和地塞米松，所述抗坏血酸的质量浓度为0.05～0.2％，所述胰岛素的质量浓度为0.05～0.2％，所述地塞米松的浓度为0.5-12μm，所述步骤(4)获得的细胞在分化培养基
ⅴ
上培养22天。
39.作为优选地，所述分化培养基ⅰ、分化培养基ⅱ、分化培养基ⅲ、分化培养基ⅳ和分化培养基
ⅴ
的ph均在7.2～7.6。
40.通过上述两种实施例提供的方法均可以定向诱导ips细胞分化生成人肝实质细胞。
41.要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物料或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物料或者设备所固
有的要素。
42.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。