一种液体酶保护剂及其应用的制作方法

1.本发明属于酶制剂技术领域，具体涉及一种液体酶保护剂及其应用。


背景技术：

2.碱性蛋白酶属内肽酶中的丝氨酸蛋白水解酶类，可以在碱性条件下水解蛋白质肽键，主要应用于加酶洗涤剂工业，在制革、丝绸、饲料、医药、食品、环保等工业也有广泛的应用。
3.市面上现有的蛋白酶产品存在大多数耐热性差，储存酶活不稳定等特性，用于食品酶中存在保质期短、无法高温利用等缺点。本发明旨在通过提供一种液体酶保护剂，并调整碱性蛋白酶的后处理制备方法，得到高稳定性，高耐热性的液体碱性蛋白酶制剂。


技术实现要素：

4.本发明的目的是克服现有技术中蛋白酶产品耐热性差，储存酶活不稳定的问题。
5.为此，本发明提供了一种液体酶保护剂，包括甲液和乙液，所述甲液与所述乙液的体积比为(5-2)：1，优选为4:1；所述甲液通过将4-羟基苯甲酸甲酯溶于丙三醇制备，浓度为0.5g/l；所述乙液通过将4-羟基苯甲酸乙酯溶于丙二醇中制备，浓度为1g/l。
6.本发明还提供了一种液体蛋白酶制剂，包括蛋白酶和上述液体酶保护剂。
7.本发明还提供了一种液体蛋白酶制剂的制备方法，包括以下步骤：
8.s1、超滤膜预处理；
9.s2、使用预处理后的超滤膜对蛋白酶进行预处理；
10.s3、配制如权利要求1所述的液体酶保护剂；
11.s4、将预处理后的蛋白酶与液体酶保护剂按(3-1)：1，优选为1:1的体积比混合，得到液体蛋白酶制剂。
12.具体的，上述步骤s1具体为：
13.(1)将超滤膜安装在有机膜分离装置中，加入氢氧化钠溶液清洗，控制压力、温度50～55℃和清洗时间；
14.(2)将氢氧化钠清洗后的超滤膜中加入纯化水冲洗，控制压力、温度，重复清洗，直至透过液的ph接近中性；
15.(3)采用焦亚硫酸钠水溶液冲洗超滤膜，控制压力、温度，循环冲洗直至透过液ph在4-5的范围内。
16.具体的，上述步骤(1)中加入1.5mol/l的氢氧化钠溶液清洗超滤膜，控制压力0.45-0.50mpa，温度50-55℃，清洗时间35min。
17.具体的，上述步骤(2)中控制压力0.25-0.30mpa，温度50-55℃，重复清洗时每次清洗时间为10min。
18.具体的，上述步骤(3)中采用0.1mol/l的焦亚硫酸钠水溶液冲洗超滤膜，控制压力0.45-0.50mpa，温度20-25℃。
19.具体的，上述步骤s2具体为：对蛋白酶发酵后得到的发酵液离心，收集液体，向收集到的液体蛋白酶中加入硅藻土，混合均匀后过滤，收集滤液，使用s1中预处理后的超滤膜过滤滤液中的杂质，得到高纯度蛋白酶酶液。
20.具体的，上述液体蛋白酶与硅藻土按(20-30)：1，优选25:1的体积比混合。
21.具体的，上述步骤s4还包括在蛋白酶与液体酶保护剂混合后，加入总体积0.5-2％的单油酸甘油酯，用焦亚硫酸钠溶液调节ph至4.5
±
0.2，得到液体蛋白酶制剂。
22.与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
23.本发明提供的这种液体酶保护剂与液体蛋白酶混合后，能够改善液体蛋白酶制剂的耐热性和稳定性。本发明提供的液体蛋白酶制剂的制备方法操作简便，成本低，酶活收率高，适合工业化生产。
具体实施方式
24.下面将结合实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。尽管已经详细描述了本发明的代表性实施例，但是本发明所属技术领域的普通技术人员将理解，在不脱离本发明范围的情况下可以对本发明进行各种修改和改变。因此，本发明的范围不应局限于实施方案，而应由所附权利要求及其等同物来限定。
25.本发明提供了一种液体酶保护剂，包括甲液和乙液，所述甲液与所述乙液的体积比为(5-2)：1；所述甲液通过将4-羟基苯甲酸甲酯溶于丙三醇制备，浓度为0.5g/l；所述乙液通过将4-羟基苯甲酸乙酯溶于丙二醇中制备，浓度为1g/l。该液体酶保护剂可与蛋白酶混合制备液体蛋白酶制剂。
26.本发明还提供了一种液体蛋白酶制剂的制备方法，包括以下步骤：
27.s1、超滤膜预处理；
28.(1)将超滤膜安装在有机膜分离装置中，加入1.5mol/l的氢氧化钠溶液清洗超滤膜，控制压力0.45-0.50mpa，温度50-55℃，清洗时间35min；
29.(2)将氢氧化钠清洗后的超滤膜中加入纯化水冲洗，控制压力0.25-0.30mpa，温度50-55℃，重复清洗，每次清洗时间为10min，直至透过液的ph接近中性；
30.(3)采用0.1mol/l的焦亚硫酸钠水溶液冲洗超滤膜，控制压力0.45-0.50mpa，温度20-25℃，循环冲洗直至透过液ph在4-5的范围内；
31.s2、使用预处理后的超滤膜对蛋白酶进行预处理；
32.对蛋白酶发酵后得到的发酵液离心，收集液体，向收集到的液体蛋白酶中加入硅藻土，液体蛋白酶与硅藻土按(20-30)：1的体积比混合均匀后过滤，收集滤液，使用s1中预处理后的超滤膜过滤滤液中的杂质，得到高纯度蛋白酶酶液；
33.s3、配制上述液体酶保护剂；
34.s4、将预处理后的蛋白酶与液体酶保护剂按(3-1)：1的体积比混合，加入总体积0.5-2％的单油酸甘油酯，用焦亚硫酸钠溶液调节ph至4.5
±
0.2，得到液体蛋白酶制剂。
35.下面通过具体实施例对本发明的液体酶保护剂、液体蛋白酶制剂及液体蛋白酶制剂的制备方法的效果进行研究。
36.实施例1：
37.本实施例提供了一种液体蛋白酶制剂的制备方法，包括以下步骤：
38.s1、超滤膜预处理
39.(1)将分子量为10kd的超滤膜安装在有机膜分离装置中，加入1.5mol/l的氢氧化钠溶液清洗超滤膜，控制压力0.45-0.50mpa，温度50-55℃，清洗时间35min；
40.(2)将氢氧化钠清洗后的超滤膜中加入纯化水冲洗，控制压力0.25-0.30mpa，温度50-55℃，重复清洗，每次清洗时间为10min，直至透过液的ph接近中性；
41.(3)采用0.1mol/l的焦亚硫酸钠水溶液冲洗超滤膜，控制压力0.45-0.50mpa，温度20-25℃，循环冲洗直至透过液ph在4-5的范围内；
42.s2、使用预处理后的超滤膜对蛋白酶进行预处理；
43.碱性蛋白酶菌种通过发酵罐发酵后，发酵液使用管式离心机在16000rpm，4℃条件下离心，收集液体，将离心机中收集的液体碱性蛋白酶与硅藻土按25:1的比例混合，搅拌均匀后，倒入安装600目丙纶滤布的板框压滤机中精滤，收集滤液，使用s1中预处理后的超滤膜过滤杂质，得到高纯度蛋白酶酶液；
44.s3、配制液体酶保护剂；
45.(1)将4-羟基苯甲酸甲酯溶于丙三醇中，配制成浓度为0.5g/l的甲液；
46.(2)将4-羟基苯甲酸乙酯溶于丙二醇中，配制成浓度为1g/l的乙液；
47.(3)将甲液和乙液按照4:1的体积比混合，得到液体酶保护剂；
48.s4、将预处理后的高纯度蛋白酶与液体酶保护剂按1:1的体积比混合，加入总体积2％的单油酸甘油酯，用焦亚硫酸钠溶液调节ph至4.5，得到液体蛋白酶制剂。
49.比较例1：
50.本比较例提供了一种液体蛋白酶制剂的制备方法，包括以下步骤：
51.s1、超滤膜预处理
52.(1)将分子量为10kd的超滤膜安装在有机膜分离装置中，加入1.5mol/l的氢氧化钠溶液清洗超滤膜，控制压力0.45-0.50mpa，温度50-55℃，清洗时间35min；
53.(2)将氢氧化钠清洗后的超滤膜中加入纯化水冲洗，控制压力0.25-0.30mpa，温度50-55℃，重复清洗，每次清洗时间为10min，直至透过液的ph接近中性；
54.(3)采用0.1mol/l的焦亚硫酸钠水溶液冲洗超滤膜，控制压力0.45-0.50mpa，温度20-25℃，循环冲洗直至透过液ph在4-5的范围内；
55.s2、使用预处理后的超滤膜对蛋白酶进行预处理；
56.碱性蛋白酶菌种通过发酵罐发酵后，发酵液使用管式离心机在16000rpm，4℃条件下离心，收集液体，将离心机中收集的液体碱性蛋白酶与硅藻土按25:1的比例混合，搅拌均匀后，倒入安装600目丙纶滤布的板框压滤机中精滤，收集滤液，使用s1中预处理后的超滤膜过滤杂质，得到高纯度蛋白酶酶液；
57.s3、配制液体酶保护剂；
58.(1)将苯甲酸钠溶于纯化水中，配制成4mol/l的水溶液；
59.s4、按1:100的体积比将水溶液与高纯度酶液混合，并加入0.1mol/l的焦亚硫酸钠溶液调节ph至4.5后得到液体蛋白酶制剂。
60.比较例2：
61.本比较例提供了一种液体蛋白酶制剂的制备方法，包括以下步骤：
62.s1、超滤膜预处理
63.(1)将分子量为10kd的超滤膜安装在有机膜分离装置中，加入1.5mol/l的氢氧化钠溶液清洗超滤膜，控制压力0.45-0.50mpa，温度50-55℃，清洗时间35min；
64.(2)将氢氧化钠清洗后的超滤膜中加入纯化水冲洗，控制压力0.25-0.30mpa，温度50-55℃，重复清洗，每次清洗时间为10min，直至透过液的ph接近中性；
65.s2、使用预处理后的超滤膜对蛋白酶进行预处理；
66.碱性蛋白酶菌种通过发酵罐发酵后，发酵液使用管式离心机在16000rpm，4℃条件下离心，收集液体，将离心机中收集的液体碱性蛋白酶与硅藻土按25:1的比例混合，搅拌均匀后，倒入安装600目丙纶滤布的板框压滤机中精滤，收集滤液，使用s1中预处理后的超滤膜过滤杂质，得到高纯度蛋白酶酶液；
67.s3、配制液体酶保护剂；
68.(1)将4-羟基苯甲酸甲酯溶于丙三醇中，配制成浓度为0.5g/l的甲液；
69.(2)将4-羟基苯甲酸乙酯溶于丙二醇中，配制成浓度为1g/l的乙液；
70.(3)将甲液和乙液按照4:1的体积比混合，得到液体酶保护剂；
71.s4、将预处理后的高纯度蛋白酶与液体酶保护剂按1:1的体积比混合，加入总体积2％的单油酸甘油酯，用焦亚硫酸钠溶液调节ph至4.5，得到液体蛋白酶制剂。
72.比较例3：
73.提供了一种液体蛋白酶制剂的制备方法，包括以下步骤：
74.s1、蛋白酶预处理；
75.碱性蛋白酶菌种通过发酵罐发酵后，发酵液使用管式离心机在16000rpm，4℃条件下离心，收集液体，将离心机中收集的液体碱性蛋白酶与硅藻土按25:1的比例混合，搅拌均匀后，倒入安装600目丙纶滤布的板框压滤机中精滤，收集滤液；
76.s2、配制液体酶保护剂；
77.(1)将4-羟基苯甲酸甲酯溶于丙三醇中，配制成浓度为0.5g/l的甲液；
78.(2)将4-羟基苯甲酸乙酯溶于丙二醇中，配制成浓度为1g/l的乙液；
79.(3)将甲液和乙液按照4:1的体积比混合，得到液体酶保护剂；
80.s3、将s1中收集的滤液与液体酶保护剂按1:1的体积比混合，加入总体积2％的单油酸甘油酯，用焦亚硫酸钠溶液调节ph至4.5，得到液体蛋白酶制剂。
81.实施例2：
82.将实施例1和比较例1-3中制备的液体蛋白酶制剂放置于45℃的恒温箱中保存，每7天检测酶活存留率，观察外观持续4周，结果见表1。
83.表1液体蛋白酶制剂的稳定性检测结果
84.[0085][0086]
将实施例1和比较例1-3中制备的液体蛋白酶制剂分别在50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃条件下水浴5min，检测酶活存留率，结果见表2。
[0087]
表2液体蛋白酶制剂的耐热性检测结果
[0088][0089]
由表1和表2可知，采用本发明提供的液体酶保护剂和方法制备的液体蛋白酶制剂的耐热性和稳定性均显著提高。
[0090]
以上例举仅仅是对本发明的举例说明，并不构成对本发明的保护范围的限制，凡是与本发明相同或相似的设计均属于本发明的保护范围之内。