基于动态限域空间的一管式分子诊断方法及其应用

1.本发明涉及生化分析和分子诊断领域，具体为一种基于动态限域空间的一管式分子诊断方法及其应用。


背景技术：

2.目前，生化分析和分子诊断领域的检测靶标主要有核酸、蛋白质等。检测的方法主要有免疫学方法、电子显微镜和分子生物学方法(如金标准qrt-pcr)等。然而，这些方法成本高、劳动强度大、需要专业的操作人员和庞大的设备，难以在资源有限的地区实施。与上述传统检测方法相比，等温核酸扩增是一种潜在的快速检测技术。例如重组酶聚合酶扩增(rpa)和环介导的等温扩增(lamp)，以其快速、简便和低成本的显著优势成为快速扩增核酸的有吸引力的替代方法。然而，它们仍存在着一定的局限性。例如，rpa有可能产生虚假扩增、对探针要求很高；而lamp易产生气溶胶污染。因此，结合rpa和lamp的级联扩增已成为解决这些问题的有效方法。在第一阶段的rpa反应中，所有的靶标将同时被扩增；并可结合第二阶段的高特异性lamp反应。且rpa-lamp受益于rpa对抑制剂的耐受性，并克服了rpa容易产生非特异性扩增的趋势。然而，当前大多数的rpa与lamp的级联扩增仍然是分步进行，并没有实现一管封闭式的级联扩增，仍然有产生lamp气溶胶污染的风险。
3.凝胶电泳和荧光法是rpa-lamp结果读出的主要技术。然而，凝胶电泳法繁琐，荧光法对设备要求高，均不适用于现场的检测。因此，也需要探索适用于现场检测的rpa-lamp比色法。
4.为了集成多种检测方法的优点以及适用于现场检测，如何将不同检测方法有效一体化是当前研究的重点。实现一体化主要问题在于利用何种介质能将不同的检测体系有机地结合起来。尤其是当结合两种不同的等温扩增方法时，需进一步考虑其不同反应温度的兼容性；如若想运用于现场的比色检测，还需考虑两个不同体系中的缓冲液是否会对最终的比色效果产生影响等。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于一种基于动态限域空间的一管式分子诊断方法及其应用。
6.为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
7.一种基于动态限域空间的一管式分子诊断方法，利用蔗糖或甘油将两种互不兼容的等温扩增反应体系置于一个反应器中，实现一管式对核酸或蛋白靶标的快速、多重、可视化检测。
8.进一步地说，利用蔗糖溶液或甘油溶液将两种互不兼容的重组酶聚合酶扩增反应体系与环介导等温扩增反应体系置于一个反应器中，并通过体系内指示剂利用颜色变化进行对核酸、蛋白等靶标的检测；且，上层为lamp体系，下层为rpa体系。
9.所述rpa体系与lamp体系两体系体积比为1-3:9-7。
10.所述rpa体系为40-60μl，往1管rpa基础反应单元里加入15-35μl rpa缓冲液、1-10
μm f3、1-10μm b3、5-15μl h20、5-15μl蔗糖溶液或甘油、1-6μl乙酸镁以及1-8μl的待检测样本；其中，蔗糖溶液为浓度为5-6％的蔗糖水溶液，甘油溶液为浓度为10-30％的甘油水溶液。
11.所述lamp体系成分为每20-60μl体系内加入5-25μl缓冲液、1-60μm混合lamp引物、0.5-2.5mm dntps、48-144μm ebt、4000-12000u/ml聚合酶、5-15μl h2o、3-15mm mgso4。
12.所述缓冲液为5-15mm koh,20-40mm(nh4)2so4、100-250mm kcl、1-5μl tween 20以及150-350μl ddh2o配制合成。
13.所述反应条件为20-50℃，10-30min；50-70℃ 10-60min；95℃ 2min。
14.上述通过颜色区分是利用ebt与lamp反应中的mg
2+
形成络合物以及lamp反应副产物ppi
4-、h
+
协同增强作用下使络合物解离的过程发生的颜色变化。
15.同时，rpa-lamp体系结果的分析：
16.(1)使用智能手机对实验前后的反应管进行拍照。
17.(2)使用色相提取软件对反应管照片进行色相数据的提取。
18.(3)运用graphpad prism8、powerpoint进行结果图的绘制。
19.所述的方法在一管式对核酸或蛋白靶标的快速、多重、可视化检测中的应用。
20.与现有技术相比，本发明的积极效果是：
21.本发明方法利用蔗糖水/甘油形成动态隔绝的氢键网络，从而制造出动态限域空间，兼容两阶段的不同反应温度，并在控制rpa与lamp体积比以及蔗糖水/甘油浓度下，实现一管封闭式的级联扩增；且利用ebt与lamp反应中的mg
2+
形成络合物以及lamp反应副产物ppi
4-、h
+
协同增强作用下使络合物解离的过程发生的颜色变化，从而实现核酸、蛋白等靶标的检测，具有检测速度快、费用低、操作步骤简单、肉眼可视、多重检测等优点，为现场快速灵敏检测核酸、蛋白等靶标提供了新的技术手段。
附图说明
22.图1为本发明实施例提供的一管式rpa-lamp的比色方法的原理。
23.图2为本发明实施例提供的一管式rpa-lamp方法检测人类诺如病毒的流程图示。
24.图3为本发明实施例提供的人类诺如病毒1型、2型的rpa-lamp反应的灵敏度，a为人类诺如病毒1型的灵敏度，b为人类诺如病毒2型的灵敏度。
25.图4为本发明实施例提供的人类诺如病毒1型、2型的rpa-lamp反应的特异度，a为未添加靶标的3组(无引物组、1型引物组、2型引物组)，b为添加人类诺如病毒1型靶标的3组(无引物组、1型引物组、2型引物组)，c为添加人类诺如病毒2型靶标的3组(无引物组、1型引物组、2型引物组)，d为添加人类诺如病毒1型+2型靶标的3组(无引物组、1型引物组、2型引物组)。
26.图5为本发明实施例提供的该方法测定粪便样本的结果比色图。
27.图6为本发明实施例提供的该方法测定水样的结果比色图。
28.图7为本发明实施例提供的该方法测定牡蛎样本的结果比色图。
29.图8为本发明实施例提供的一管式rpa-lamp不同体积比效果图。
30.图9为本发明实施例提供的基于不同浓度蔗糖水的一管式rpa-lamp比色图。
31.图10为本发明实施例提供的基于商业化缓冲液的一管式rpa-lamp比色图。
real-time reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification assay[j].journal of clinical microbiology,2006,44(4):1376.[2]yoda t,suzuki y,yamazaki k,et al.erratum:evaluation and application of reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for detection of noroviruses(journal of medical virology(2007)79,(326-334)).2007.
[0040]
(2)自制缓冲液的配制：由12mm koh,31mm(nh4)2so4、155mm kcl、1μl tween 20以及280μl ddh2o配制合成。
[0041]
(3)lamp体系的构建：一个lamp体系为42μl；由14.4步骤(2)的自制缓冲液、混合引物(人类诺如病毒1型/2型的3.8μm f3、3.8μm b3、30.8μm fip、30.8μm bip、15.4μm lf、15.4μm lb六条引物)、1.4mm dntps、72μm ebt、8000u/ml聚合酶、10.8μl h2o、8mm mgso4。
[0042]
(4)rpa-lamp体系的构建：一个rpa-lamp体系为50μl；先往200μl的管子里加入35μl的lamp反应液；再将移液枪伸入管子底部加入混有蔗糖溶液的15μl rpa反应液；靠着液体压力作用使之在动态限域空间内形成上层为lamp体系，下层为rpa体系。
[0043]
(5)反应装置及条件：反应均在cfx96 touch
tm real-time pcr detection system(bio-rad,usa)上进行；反应条件为39℃，15min；65℃，45min；95℃ 2min。
[0044]
(6)以上实验平行重复三次。
[0045]
(7)运用智能手机对反应后的对照组与实验组的反应管进行拍照，并用色相提取软件提取数据，最后用graphad prism8进行柱状图的绘制。
[0046]
由图3a可见，与对照组相比，实验组中10、102、103、104、105copies/μl组的色相值与对照组的色相值差别在100
°
左右(即反应管颜色为蓝色)；表明这五组实验组均发生了扩增，即人类诺如病毒1型的检测灵敏度可达到10copies/μl；同理，由图3b可知人类诺如病毒1型的检测灵敏度可达到1copies/μl。
[0047]
实施例2：人类诺如病毒1型、2型的rpa-lamp反应的特异度
[0048]
(1)rpa体系的构建：使用的是奇天的rpa试剂盒，一个rpa体系为50μl；往1管rpa基础反应单元里加入25μl rpa缓冲液、4μm f3(人类诺如病毒1型/2型)、4μm b3(人类诺如病毒1型/2型)、9.5μl h20、5μl 5％的蔗糖水、2.4μl乙酸镁以及4μl的样本即合成质粒
[1-2]
(实验组)/h2o(对照组)。
[0049]
(2)自制缓冲液的配制：由12mm koh,31mm(nh4)2so4、155mm kcl、1μl tween 20以及280μl ddh2o配制合成。
[0050]
(3)lamp体系的构建：一个lamp体系为42μl；由14.4步骤(2)的自制缓冲液、混合引物(人类诺如病毒1型/2型的3.8μm f3、3.8μm b3、30.8μm fip、30.8μm bip、15.4μm lf、15.4μm lb六条引物)、1.4mm dntps、72μm ebt、8000u/ml聚合酶、10.8μl h2o、8mm mgso4。
[0051]
(4)rpa-lamp体系的构建：一个rpa-lamp体系为50μl；先往200μl的管子里加入35μl的lamp反应液；再将移液枪伸入管子底部加入混有蔗糖溶液的15μl rpa反应液；靠着液体压力作用使之在动态限域空间内形成上层为lamp体系，下层为rpa体系。
[0052]
(5)反应装置及条件：反应均在cfx96 touch
tm real-time pcr detection system(bio-rad,usa)上进行；反应条件为39℃，15min；65℃，45min；95℃ 2min。
[0053]
(6)以上实验平行重复三次。
[0054]
(7)运用智能手机对反应后的对照组与实验组的反应管进行拍照，并用色相提取
软件提取数据，最后用graphad prism8进行柱状图的绘制。
[0055]
由图4a三组不同对照可知该实验没有产生假阳性扩增；由图4b可知，均添加了人类诺如病毒1型靶标的实验组中只有人类诺如病毒1型引物组的色相值与对照组的色相值差别在100
°
左右(即反应管颜色为蓝色)；表明该实验组发生了扩增，即证明了该反应对人类诺如病毒1型的特异度；同理图4c与图4d分别证明了该反应对人类诺如病毒2型与人类诺如病毒1型+人类诺如病毒2型的特异度。
[0056]
实施例3：粪便样本中人类诺如病毒1型、2型的检测。
[0057]
(1)样本的获取：粪便样本来自上海市疾控中心。
[0058]
(2)rpa体系的构建：使用的是奇天的rpa试剂盒，一个rpa体系为50μl；往1管rpa基础反应单元里加入25μl rpa缓冲液、4μm f3(人类诺如病毒1型/2型)、4μm b3(人类诺如病毒1型/2型)、9.5μl h20、5μl 5％的蔗糖水、2.4μl乙酸镁以及4μl的粪便样本(实验组)/h2o(对照组)。
[0059]
(3)自制缓冲液的配制：由12mm koh,31mm(nh4)2so4、155mm kcl、1μl tween 20以及280μl ddh2o配制合成。
[0060]
(4)lamp体系的构建：一个lamp体系为42μl；由14.4步骤(3)的自制缓冲液、混合引物(人类诺如病毒1型/2型的3.8μm f3、3.8μm b3、30.8μm fip、30.8μm bip、15.4μm lf、15.4μm lb六条引物)、1.4mm dntps、72μm ebt、8000u/ml聚合酶、10.8μl h2o、8mm mgso4。
[0061]
(5)rpa-lamp体系的构建：一个rpa-lamp体系为50μl；先往200μl的管子里加入35μl的lamp反应液；再将移液枪伸入管子底部加入混有蔗糖溶液的15μl rpa反应液；靠着液体压力作用使之在动态限域空间内形成上层为lamp体系，下层为rpa体系。
[0062]
(6)反应装置及条件：反应均在cfx96 touch
tm real-time pcr detection system(bio-rad,usa)上进行；反应条件为39℃，15min；65℃，45min；95℃ 2min。
[0063]
(7)以上实验平行重复三次。
[0064]
(8)运用智能手机对反应后的对照组与实验组的反应管进行拍照，并用色相提取软件提取数据，最后用graphad prism8进行柱状图的绘制。
[0065]
由图5可见，与对照组相比，实验组中只有人类诺如病毒2型引物组的色相值与对照组的色相值差别在100
°
左右(即反应管颜色为蓝色)；表明改实验组发生了扩增，即从粪便样本中检测到了人类诺如病毒2型。
[0066]
实施例4：水样中人类诺如病毒1型、2型的检测。
[0067]
(1)样品的获取：水样来自上海市崇明岛河水。
[0068]
(2)rpa体系的构建：使用的是奇天的rpa试剂盒，一个rpa体系为50μl；往1管rpa基础反应单元里加入25μl rpa缓冲液、4μm f3(人类诺如病毒1型/2型)、4μm b3(人类诺如病毒1型/2型)、9.5μl h20、5μl 5％的蔗糖水、2.4μl乙酸镁以及4μl的水样(实验组)/h2o(对照组)。
[0069]
(3)自制缓冲液的配制：由12mm koh,31mm(nh4)2so4、155mm kcl、1μl tween 20以及280μl ddh2o配制合成。
[0070]
(4)lamp体系的构建：一个lamp体系为42μl；由14.4步骤(3)的自制缓冲液、混合引物(人类诺如病毒1型/2型的3.8μm f3、3.8μm b3、30.8μm fip、30.8μm bip、15.4μm lf、15.4μm lb六条引物)、1.4mm dntps、72μm ebt、8000u/ml聚合酶、10.8μl h2o、8mm mgso4。
[0071]
(5)rpa-lamp体系的构建：一个rpa-lamp体系为50μl；先往200μl的管子里加入35μl的lamp反应液；再将移液枪伸入管子底部加入混有蔗糖溶液的15μl rpa反应液；靠着液体压力作用使之在动态限域空间内形成上层为lamp体系，下层为rpa体系。
[0072]
(6)反应装置及条件：反应均在cfx96 touch
tm real-time pcr detection system(bio-rad,usa)上进行；反应条件为39℃，15min；65℃，45min；95℃ 2min。
[0073]
(7)以上实验平行重复三次。
[0074]
(8)运用智能手机对反应后的对照组与实验组的反应管进行拍照，并用色相提取软件提取数据，最后用graphad prism8进行柱状图的绘制。
[0075]
由图6可见，与对照组相比，实验组人类诺如病毒1型引物组与人类诺如病毒2型引物组的色相值与对照组的色相值差别均在100
°
左右(即反应管颜色皆为蓝色)；表明两组实验组均发生了扩增，即从水样中检测到了人类诺如病毒1型与人类诺如病毒2型。
[0076]
实施例5：牡蛎样本中人类诺如病毒1型、2型的检测。
[0077]
(1)样品的获取：牡蛎样本来自上海市崇明区菜市场。
[0078]
(2)rpa体系的构建：使用的是奇天的rpa试剂盒，一个rpa体系为50μl；往1管rpa基础反应单元里加入25μl rpa缓冲液、4μm f3(人类诺如病毒1型/2型)、4μm b3(人类诺如病毒1型/2型)、9.5μl h20、5μl 5％的蔗糖水、2.4μl乙酸镁以及4μl的牡蛎样本(实验组)/h2o(对照组)。
[0079]
(3)自制缓冲液的配制：由12mm koh,31mm(nh4)2so4、155mm kcl、1μl tween 20以及280μl ddh2o配制合成。
[0080]
(4)lamp体系的构建：一个lamp体系为42μl；由14.4步骤(3)的自制缓冲液、混合引物(人类诺如病毒1型/2型的3.8μm f3、3.8μm b3、30.8μm fip、30.8μm bip、15.4μm lf、15.4μm lb六条引物)、1.4mm dntps、72μm ebt、8000u/ml聚合酶、10.8μl h2o、8mm mgso4。
[0081]
(5)rpa-lamp体系的构建：一个rpa-lamp体系为50μl；先往200μl的管子里加入35μl的lamp反应液；再将移液枪伸入管子底部加入混有蔗糖溶液的15μl rpa反应液；靠着液体压力作用使之在动态限域空间内形成上层为lamp体系，下层为rpa体系。
[0082]
(6)反应装置及条件：反应均在cfx96 touch
tm real-time pcr detection system(bio-rad,usa)上进行；反应条件为39℃，15min；65℃，45min；95℃ 2min。
[0083]
(7)以上实验平行重复三次。
[0084]
(8)运用智能手机对反应后的对照组与实验组的反应管进行拍照，并用色相提取软件提取数据，最后用graphad prism8进行柱状图的绘制。
[0085]
由图7可见，与对照组相比，实验组中只有人类诺如病毒1型引物组的色相值与对照组的色相值差别在100
°
左右(即反应管颜色为蓝色)；表明改实验组发生了扩增，即从牡蛎样本中检测到了人类诺如病毒1型。
[0086]
实施例6：一管式rpa-lamp不同体积比效果图
[0087]
(1)rpa体系的构建：使用的是奇天的rpa试剂盒，一个rpa体系为50μl；往1管rpa基础反应单元里加入25μl rpa缓冲液、4μm f3(人类诺如病毒1型/2型)、4μm b3(人类诺如病毒1型/2型)、9.5μl h20、5μl 5％的蔗糖水、2.4μl乙酸镁以及4μl的样本即合成质粒
[1-2]
(实验组)/h2o(对照组)。
[0088]
(2)自制缓冲液的配制：由12mm koh,31mm(nh4)2so4、155mm kcl、1μl tween 20以
及280μl ddh2o配制合成。
[0089]
(3)lamp体系的构建：一个lamp体系为42μl；由14.4步骤(2)的自制缓冲液、混合引物(人类诺如病毒1型/2型的3.8μm f3、3.8μm b3、30.8μm fip、30.8μm bip、15.4μm lf、15.4μm lb六条引物)、1.4mm dntps、72μm ebt、8000u/ml聚合酶、10.8μl h2o、8mm mgso4。
[0090]
(4)rpa-lamp体系的构建：一个rpa-lamp体系为50μl；先往200μl的管子里加入45/35/25/15/5μl的lamp反应液；再将移液枪伸入管子底部加入混有蔗糖溶液的5/15/25/35/45μl rpa反应液；靠着液体压力作用使之在动态限域空间内形成上层为lamp体系，下层为rpa体系。
[0091]
(5)反应装置及条件：反应均在cfx96 touch
tm real-time pcr detection system(bio-rad,usa)上进行；反应条件为39℃，15min；65℃，45min；95℃ 2min。
[0092]
(6)以上实验平行重复三次。
[0093]
(7)运用智能手机对反应后的对照组与实验组的反应管进行拍照，并用色相提取软件提取数据，最后用graphad prism8进行柱状图的绘制。
[0094]
由图8可见，根据对照组与实验组反应管的颜色及其色相值的差值(在一定范围内差值越大，比色效果越明显)；rpa与lamp的体积比中5:45、15：35均有变化；其中，rpa与lamp的最适体积比为15：35。由此可见即使在蔗糖溶液存在下，只有在特定体积比下才能实现最终效果。
[0095]
实施例7：基于不同浓度蔗糖水的一管式rpa-lamp比色图
[0096]
(1)rpa体系的构建：使用的是奇天的rpa试剂盒，一个rpa体系为50μl；往1管rpa基础反应单元里加入25μl rpa缓冲液、4μm f3(人类诺如病毒1型/2型)、4μm b3(人类诺如病毒1型/2型)、9.5μl h20、5μl 5％的蔗糖水、2.4μl乙酸镁以及4μl的样本即合成质粒
[1-2]
(实验组)/h2o(对照组)。
[0097]
(2)自制缓冲液的配制：由12mm koh,31mm(nh4)2so4、155mm kcl、1μl tween 20以及280μl ddh2o配制合成。
[0098]
(3)lamp体系的构建：一个lamp体系为42μl；由14.4步骤(2)的自制缓冲液、混合引物(人类诺如病毒1型/2型的3.8μm f3、3.8μm b3、30.8μm fip、30.8μm bip、15.4μm lf、15.4μm lb六条引物)、1.4mm dntps、72μm ebt、8000u/ml聚合酶、10.8μl h2o、8mm mgso4。
[0099]
(4)rpa-lamp体系的构建：一个rpa-lamp体系为50μl；先往200μl的管子里加入35μl的lamp反应液；再将移液枪伸入管子底部加入混有0％、2％、5％、10％蔗糖溶液的15μl rpa反应液；靠着液体压力作用使之在动态限域空间内形成上层为lamp体系，下层为rpa体系。
[0100]
(5)反应装置及条件：反应均在cfx96 touch
tm real-time pcr detection system(bio-rad,usa)上进行；反应条件为39℃，15min；65℃，45min；95℃ 2min。
[0101]
(6)以上实验平行重复三次。
[0102]
(7)运用智能手机对反应后的对照组与实验组的反应管进行拍照，并用色相提取软件提取数据，最后用graphad prism8进行柱状图的绘制。
[0103]
由图9可见，根据对照组与实验组反应管的颜色及其色相值的差值(在一定范围内差值越大，比色效果越明显)；由图示所示只有在蔗糖水浓度为5％时才能清晰比对，其它浓度下效果不明显，因此体系只有在合适的蔗糖浓度下才能具有效果。
[0104]
对比例1：基于商业化缓冲液的一管式rpa-lamp比色图
[0105]
(1)rpa体系的构建：使用的是奇天的rpa试剂盒，一个rpa体系为50μl；往1管rpa基础反应单元里加入25μl rpa缓冲液、4μm f3(人类诺如病毒1型/2型)、4μm b3(人类诺如病毒1型/2型)、9.5μl h20、5μl 5％的蔗糖水、2.4μl乙酸镁以及4μl的样本即合成质粒
[1-2]
(实验组)/h2o(对照组)。
[0106]
(2)基于商业化缓冲液lamp体系的构建：一个lamp体系为45.9μl；由22.5μl商业化lamp缓冲液、人类诺如病毒1型/2型的15.7μm fip、15.7μm bip、2μm f3、2μm b3、7.8μm lf、7.8μm lb。
[0107]
(3)基于商业化缓冲液rpa-lamp体系的构建：一个rpa-lamp体系为50μl；先往200μl的管子里加入15μl的lamp反应液；再将移液枪伸入管子底部加入混有蔗糖溶液的35μl rpa反应液；靠着液体压力作用使之在动态限域空间内形成上层为lamp体系，下层为rpa体系。
[0108]
(4)反应装置及条件：反应均在cfx96 touch
tm real-time pcr detection system(bio-rad,usa)上进行；反应条件为39℃，15min；65℃，45min；95℃ 2min。
[0109]
(5)以上实验平行重复三次。
[0110]
(6)运用智能手机对反应后的对照组与实验组的反应管进行拍照，并用色相提取软件提取数据，最后用graphad prism8进行柱状图的绘制。
[0111]
由图10可见，与对照组相比，实验组的扩增曲线显示有扩增；但实验组的反应管却未变成理想阳性组所呈现的黄色，证明基于商业化的rpa-lamp无法实现现场的比色检测。