一种外周血单个核细胞分离方法与流程

1.本发明涉及细胞分离技术领域，尤其涉及一种外周血单个核细胞分离方法。


背景技术：

2.外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，pbmc)主要指淋巴细胞和单核细胞，是免疫学实验最常用的细胞，具有较强的体外培养扩增潜能。目前，单个核细胞治疗已在国内外得到大范围的研究与推广，疾病通过体外培养、增殖、激活，回输体内即可诱导自体抗病毒免疫应答，人体抗病毒免疫一旦被激活就会源源不断产生抗病毒的物质杀灭病毒。有杀伤肿瘤细胞作用的t细胞经激活后在体内大多数变为记忆细胞储存在淋巴组织内，为彻底清除肿瘤细胞和防治转移复发提供了长期保护。随着年龄增长，体内外周血单个核细胞活性也随之降低，所以在年轻的时期冻存具有较高活力的单个核细胞，对于未来免疫治疗有着重要意义。
3.目前外周血单个核细胞分离，主要采用ficoll方法，目前该方法存在以下不足：
4.1、操作相对复杂，需精准控制铺层速度，对操作人员熟练度要求较高，另外样本手工开放式操作时间长，引入外源性污染风险高；
5.2、需要多次离心操作，高速离心对细胞容易造成损伤，使分离得到细胞活率较低；
6.3、单个核细胞回收率较低且操作时间长，不适用于批量外周血的分离操作。
7.针对上述ficoll方法分离外周血单个核细胞存在的一系列不足，因此急需一种全新分离方法，解决目前外周血单个核分离操作复杂、操作时间长、易对细胞造成损伤、细胞回收率低、引入外源性污染风险高等技术难题。


技术实现要素：

8.本发明所要解决的技术问题是目前的外周血单个核细胞分离方法存在操作复杂、操作时间长、易对细胞造成损伤、细胞回收率低、引入外源性污染风险高。
9.为了解决上述问题，本发明提出以下技术方案：
10.一种外周血单个核细胞分离方法，采用分离装置对外周血单个核细胞进行分离，所述分离装置，包括取样单元、加样单元、连接件、静置袋以及转移袋；所述取样单元、加样单元以及所述静置袋均与所述连接件连接，所述连接件将所述静置袋与所述取样单元以及所述加样单元连通；所述静置袋与所述转移袋之间用管道连通；所述转移袋连接有末端封闭的管道；
11.所述分离方法包括以下步骤：
12.s1、使用消毒酒精对采血袋表面进行消毒，传入正常开启的生物安全柜内，并轻揉采血袋，使袋内血液充分混匀；
13.s2、利用取样单元对采血袋内的血液进行取样，使血液经连接件由采血袋转移至静置袋内；
14.s3、向加样单元中加入羟乙基淀粉，使羟乙基淀粉经连接件转移至静置袋内，与血
液充分混匀；
15.s4、封闭连接件与静置袋之间的连通管路，将静置袋倒挂，进行血液静置分离；
16.s5、待静置袋内的上清与沉淀比例达到1:1时，将上清液由静置袋转移至转移袋内；
17.s6、使用消毒酒精对转移袋连接的末端封闭管道进行消毒，用无菌剪刀剪开管道，将转移袋内的上清液转移至离心管内；
18.s7、将装有上清液的离心管，使用移液管取样计算细胞数量及活率；
19.s8、在室温下，以参数为200-500g、3-10min对s7的离心管进行离心；
20.s9、去除离心上清，根据s7的计数结果，按预设冻存密度加入提前4℃预冷的冻存液，混匀分装至冻存管内，得到装有单个核细胞的冻存管；
21.s10、将分装于冻存管的单个核细胞进行程序降温，降温结束后转移至-150℃以下的液氮罐储存。
22.需要说明的是，所述消毒酒精为医用消毒酒精，浓度为75％(体积分数)。
23.在一个或多个实施方案中，本发明的步骤s8，离心参数可以是200g、300g、400g、或500g；离心时间可以是3min、4min、5min、7min、9min，或10min。
24.其进一步的技术方案为，所述步骤s1和s2之间还包括：使用一次性注射器从采血袋的开口端穿刺取样，用于全血细胞计数。需要说明的是，对于步骤s7以及上述取样计数的操作，一般取0.5ml血样进行细胞数量计数。
25.其进一步的技术方案为，所述步骤s1之前还包括对采血袋称重，获取血液的重量，通过单位换算将血液的重量单位换算为体积单位。
26.在实际操作中，按1.03的比例将血液对重量单位转化为体积单位；例如，外周血的重量记为g(克)，其体积v＝g/1.03(毫升)。
27.其进一步的技术方案为，所述步骤s3中，按羟乙基淀粉的体积与血液的体积比为1:3～1:5的比例进行添加。
28.其进一步的技术方案为，所述步骤s9中，预设的冻存密度为1*107～4*107个/ml。
29.其进一步的技术方案为，所述步骤s9中，所述冻存液由基础免疫培养基、dmso和人血红蛋白按18:1:1的体积比混合配制而成。
30.其进一步的技术方案为，所述步骤s5中，使用分浆夹将上清由静置袋转移至转移袋内。
31.其进一步的技术方案为，所述连接件为三通管，所述三通管包括三个接口，所述三通管的三个接口分别与所述取样单元、所述加样单元以及所述静置袋连接。
32.其进一步的技术方案为，所述取样单元包括穿刺器，将所述取样单元与所述连接件之间的连通管道记为第一液体输送管，所述第一液体输送管的两端分别与所述穿刺器以及所述三通管的接口连接。
33.具体实施中，步骤s2中，用取样单元的穿刺器进行取样，血液由穿刺器经第一液体输送管、连接件，由采血袋转移至静置袋内。
34.其进一步的技术方案为，所述取样单元与连接件之间的连通管道上设有第一开关，用于控制取样单元与连接件之间的管路连通状态。即所述第一液体输送管上设有第一开关，用于控制第一液体输送管的连通状态。
35.其进一步的技术方案为，所述穿刺器的末端为形状类似三角形的尖端。
36.其进一步的技术方案为，将所述加样单元与所述连接件之间的连通管道记为第二液体输送管，所述加样单元包括胶塞，所述胶塞密封设于所述第二液体输送管的一端，所述第二液体输送管的另一端与所述三通管的接口连通。
37.其进一步的技术方案为，所述步骤s4中封闭连接件与静置袋之间的连通管路，具体是指热合密封的方式来封闭连接件与静置袋之间的连通管路。
38.更具体的实施方案中，热合密封连接件与静置袋之间管路，然后将靠近连接件端的管路切断。
39.具体实施中，将所述连接件与静置袋之间的连通管道记为第三液体输送管，所述第三液体输送管的两端分别与所述静置袋以及所述三通管的接口连通。所述步骤s4中封闭连接件与静置袋之间的连通管路，具体是指热合密封第三液体输送管，更进一步的，可以将密封后靠近连接件端的管路切断。
40.其进一步的技术方案为，所述静置袋与所述转移袋之间的连通管道上设有第二开关，用于控制静置袋与所述转移袋之间的管道连通状态。
41.具体实施中，将所述静置袋与所述转移袋之间的连通管道记为第四液体输送管，即所述第四液体输送管上设有第二开关，用于控制第四液体输送管的连通状态。
42.其进一步的技术方案为，所述静置袋包括第一内腔，所述第一内腔包括相对的第一侧以及第二侧，所述第一内腔的内径由所述第一侧到所述第二侧逐渐减小，所述第四液体输送管连接至所述第二侧。
43.其进一步的技术方案为，所述分离装置在使用前先辐照灭菌，使其处于无菌状态。
44.与现有技术相比，本发明所能达到的技术效果包括：
45.本发明提供的外周血单个核细胞分离方法，采用分离装置对外周血单个核细胞进行分离，通过取样单元将采血袋内的外周血样品经过连接件转移到静置袋中。进一步地，通过加样单元将羟乙基淀粉，经过连接件添加到静置袋中，使羟乙基淀粉与血液混匀。之后密封(例如采用热合密封的方式)静置袋与连接件之间的管路，将静置袋倒挂静置，使转移袋位于静置袋的上侧。待静置袋内的上清液与沉淀分层时，通过缓慢挤压静置袋将上清液转移到转移袋中，从而实现对上清液中的外周血单个核细胞的快速分离。分离装置具有结构简单、密闭性好的优点，使得分离方法操作简单、时间短、对细胞损伤小、外源性污染风险小。
46.利用本发明提供的外周血单个核细胞分离方法进行单个核细胞分离，具有分离效率高，对细胞损伤小，wbc回收率高的优点。
附图说明
47.为了更清楚地说明本发明实施例技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
48.图1为本发明实施例提出的一种分离装置的结构示意图。
49.附图标记
50.取样单元10、加样单元20、连接件30、静置袋40、转移袋50、第一开关60、第三液体
输送管70、第四液体输送管80、第二开关90、密闭管路100、三通管31、接口32、穿刺器11、第一液体输送管12、尖端111、第二液体输送管21、胶塞22、第一内腔41、第一侧411、第二侧412以及第二内腔51。
具体实施方式
51.下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，以下将描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
52.应当理解，当在本说明书和所附权利要求书中使用时，术语“包括”和“包含”指示所描述特征、整体、步骤、操作、元素和/或组件的存在，但并不排除一个或多个其它特征、整体、步骤、操作、元素、组件和/或其集合的存在或添加。
53.还应当理解，在此本发明实施例说明书中所使用的术语仅仅是出于描述特定实施例的目的而并不意在限制本发明实施例。如在本发明实施例说明书和所附权利要求书中所使用的那样，除非上下文清楚地指明其它情况，否则单数形式的“一”、“一个”及“该”意在包括复数形式。
54.实施例1
55.本发明实施例提供一种外周血单个核细胞分离方法，采用分离装置对外周血单个核细胞进行分离，所述分离装置的结构示意图如图1所示。
56.所述分离装置包括取样单元10、加样单元20、连接件30、静置袋40以及转移袋50。各部件的连接关系及结构具体介绍如下：
57.所述取样单元10、加样单元20以及所述静置袋40均与所述连接件30连接，所述连接件30将所述静置袋40与所述取样单元10以及所述加样单元20连通；所述静置袋40与所述转移袋50之间用管道连通；所述转移袋50连接有末端封闭的管道，所述末端封闭的管道记为密闭管路100。
58.本发明实施例所用的分离装置，可通过取样单元10将采血袋内的外周血样品经过连接件30添加到静置袋40中。进一步地，通过加样单元20将分离外周血单个核细胞所需用到的制剂，比如羟乙基淀粉，经过连接件30添加到静置袋40中，使之与血液混匀。之后密封(例如采用热合密封的方式)静置袋40与连接件30之间的管路(即第三液体输送管70)，将静置袋40倒挂静置，使得转移袋50位于静置袋40的上侧。待静置袋40内的上清液与沉淀分层时，通过缓慢挤压静置袋40将上清液转移到转移袋50中，从而实现对上清液中的外周血单个核细胞的快速分离。
59.进一步地，所述连接件30为三通管31，所述三通管31包括三个接口32，所述三通管31的三个接口32分别与所述取样单元10、所述加样单元20以及所述静置袋40连接。通过三通管31能够实现将所述静置袋40与所述取样单元10以及所述加样单元20连通。
60.进一步地，所述取样单元10包括穿刺器11，将所述取样单元10与所述连接件30之间的连通管道记为第一液体输送管12，所述第一液体输送管12的两端分别与所述穿刺器11以及所述三通管31的接口32连通。
61.具体的分离方法中，用取样单元10的穿刺器11进行取样，血液由穿刺器11经第一
液体输送管12、连接件30，由采血袋转移至静置袋40内。将穿刺器11扎入采血袋的旋帽开口端并拧紧，即可实现对外周血样品的取样。第一液体输送管12可具体为硅胶软管。第一液体输送管12的长度可具体为20cm。
62.进一步地，所述取样单元10与连接件30之间的连通管道上设有第一开关60，用于控制取样单元10与连接件30之间的管路连通状态。即所述第一液体输送管12上设有第一开关60，用于控制第一液体输送管12的连通状态。第一开关60用于开启或关断所述第一液体输送管12。本实施例中，第一开关60具体为止水夹，本领域技术人员也可以采用其它开关器件，对此本发明不做具体限定。
63.进一步地，所述穿刺器11的末端为形状为三角形的尖端111，类似于针头形状，便于扎入到采血袋的旋帽开口端中。
64.进一步地，将所述加样单元20与所述连接件30之间的连通管道记为第二液体输送管21，所述加样单元20包括胶塞22，所述胶塞22密封设于所述第二液体输送管21的一端，所述第二液体输送管21的另一端与所述三通管31的接口32连接。通过注射器穿过所述胶塞22，即可向静置袋40内输送分离外周血单个核细胞所需用到的制剂，比如羟乙基淀粉。胶塞22一方面实现管路密封，另一方面能够实现对制剂的输送。第二液体输送管21可具体为硅胶软管。
65.在本发明的分离方法中，所述步骤s4中，封闭连接件30与静置袋40之间的连通管路，具体是指采用切断后热合密封的方式来封闭连接件30与静置袋40之间的连通管路。
66.具体实施中，将所述连接件30与静置袋40之间的连通管道记为第三液体输送管70，所述第三液体输送管70的两端分别与所述静置袋40以及所述三通管31的接口32连通。所述步骤s4中封闭连接件30与静置袋40之间的连通管路，具体是指采用热合密封的方式封闭第三液体输送管30。第三液体输送管70可具体为硅胶软管。第三液体输送管70的长度可具体为20cm。
67.具体实施中，热合密封完第三液体输送管之后，可将靠近连接件端的管路切断，使分离装置变得简单，便于后续的操作。
68.进一步地，所述静置袋40与所述转移袋50之间的连通管道上设有第二开关90，用于控制静置袋40与所述转移袋50之间的管道连通状态。具体实施中，将所述静置袋40与所述转移袋50之间的连通管道记为第四液体输送管80，即所述第四液体输送管80上设有第二开关90，用于控制第四液体输送管80的连通状态。
69.所述第四液体输送管80分别与所述静置袋40以及所述转移袋50连接；所述第二开关90设于所述第四液体输送管80上。第四液体输送管80用于连通所述静置袋40以及所述转移袋50。所述第二开关90用于有效实现对所述第四液体输送管80的开启/关断控制。本实施例中，第二开关90具体为滑轮调速夹，滑轮调速夹还能够实现液体流量的控制。本领域技术人员也可以采用其它开关器件，对此本发明不做具体限定。第四液体输送管80可具体为硅胶软管。第四液体输送管80的长度可具体为20cm。
70.进一步地，所述静置袋40包括第一内腔41，所述第一内腔41包括相对的第一侧411以及第二侧412，所述第一内腔41的内径由所述第一侧411到所述第二侧412逐渐减小，所述第四液体输送管80连接至所述第二侧412。可见，第一内腔41的形状近似为三角形，并且三角形的尖角(即第二侧412)与所述第四液体输送管80连接。由此，可使得沉淀集中在所述第
一内腔41的第一侧411，便于对上清液的分离。第一内腔41的容量可具体为200ml。
71.进一步地，转移袋50包括第二内腔51，第二内腔51的形状近似为方形。第二内腔51的容量可具体为100ml。
72.以下详细介绍本发明提供的外周血单个核细胞分离方法，所述分离方法包括以下步骤：
73.s0、对采血袋称重，获取血液的重量，通过单位换算将血液的重量单位换算为体积单位。在实际操作中，按1.03的比例将血液对重量单位转化为体积单位；例如，将外周血的重量记为g(克)，其体积v＝g/1.03(毫升)。
74.s1、使用75％酒精对采血袋表面进行消毒，传入正常开启的生物安全柜内，并轻揉采血袋，使袋内血液充分混匀。
75.s11、使用一次性注射器从采血袋的开口端穿刺取0.5ml血样，用于全血细胞计数。
76.s12、使用分离装置前先辐照灭菌，使其处于无菌状态，检查并开启分离装置，关紧第一开关和第二开关；
77.s2、利用取样单元对采血袋内的血液进行取样，使血液经连接件由采血袋转移至静置袋内；
78.具体将穿刺器扎入采血袋旋帽开口端并拧紧；举起采血袋，打开第一开关，使采血袋内的外周血流入静置袋内。
79.s3、采血袋内外周血全部转移至静置袋后，使用一次性注射器通过胶塞将羟乙基淀粉按羟乙基淀粉：血液的体积1:3的比例经连接件转移至静置袋内，并轻柔混合与血液充分混匀；
80.s4、封闭连接件与静置袋之间的连通管路，将静置袋倒挂，进行血液静置分离；具体是热合密封连接件与静置袋之间管路，然后将靠近连接件端的管路切断，将静置袋倒置悬挂，去除静置袋上残液，挤掉气泡，进行静置分离。
81.s5、待静置袋内的上清与沉淀比例达到1:1时，使用分浆夹将上清液由静置袋挤出转移至转移袋内，关紧第二开关，从分浆夹上取下分离装置，将分离装置传入生物安全柜；
82.s6、使用75％酒精对转移袋连接的末端封闭管道进行消毒，用无菌剪刀剪开管道，将转移袋内的上清液转移至离心管内；
83.s7、将装有上清液的离心管，使用移液管取0.5ml计细胞数量及活率；
84.s8、在室温下，以参数为200g、5min对s7的离心管进行离心；
85.s9、去除离心上清，根据计数结果，根据计数结果，按2*107个/ml的冻存密度加入提前4℃预冷的由基础免疫培养基、dmso和人血红蛋白按18:1:1的体积比混合配制的冻存液，混匀分装至冻存管内。
86.s10、将分装于冻存管的单个核细胞进行程序降温，降温结束后转移至-150℃以下的液氮罐储存。
87.对比例1
88.使用传统ficoll法分离外周血单个核细胞，具体步骤如下：
89.s1、将采血袋内的外周血均分转移至50ml离心管内，取0.5ml进行全血计数。
90.s2、将装有外周血的离心管离心，离心条件为：室温，900g，15min；
91.s3、去除离心后的上清液，使用0.9％氯化钠注射液将沉淀混匀，并定容至30ml。
92.s4、将稀释后的细胞沉淀缓慢铺加至提前添加了20ml分离液的50ml离心管中，每管添加30ml，保证分离液与稀释血液界面清晰。
93.s5、对s4的离心管离心，离心条件为：室温，600g，15min。
94.s6、离心结束后，吸取单个核细胞层至50ml离心管内，用0.9％氯化钠注射液定容至50ml，并混匀。
95.s7、对s5的离心管离心，离心条件为：室温，600g，10min。
96.s8、离心结束后，弃上清，将细胞沉淀合并至1个离心管，用0.9％氯化钠注射液定容至50ml，并混匀，取0.5ml检测细胞数量和细胞活率。
97.s9、对s8的离心管离心，离心条件为：室温，200g，5min。
98.s10、离心结束后，弃上清，根据计数结果，按2*107个/ml的冻存密度加入提前4℃预冷的冻存液，混匀分装至冻存管内。
99.s11、将分装于冻存管的单个核细胞进行程序降温，降温结束后转移至-150℃以下液氮罐储存。
100.按实施例1、对比例1提供的分离方法各分离6份样本，得到的具体实验数据如下表1所示。
101.表1按实施例1、对比例1的操作步骤各分离6份样本的数据
[0102][0103][0104]
通过操作过程的对比可知，对比例1的方法需要对血液样本离心多次，这种操作对细胞损伤大；多次向其中加入0.9％氯化钠进行稀释定容，极易引入外源性污染。同时，表1的数据也表明：
[0105]
1、采用实施例1的方法分离的6份样本平均wbc回收率为77.37％，相较对比例1，回收率大幅度提升，提升将近4.5倍；
[0106]
2、采用实施例1的方法分离的6份样本平均活率为99.85％，较对比例1，提升了21.33％；
[0107]
3、采用实施例1的方法分离的6份样本平均操作时间为60.17min，较对比例1，每份样本节省时间为72.53min，效率提升54.66％；
[0108]
4、采用实施例1的方法分离的6份样本需厌氧菌及真菌检测均为阴性，但对比例只
有5份样本检测为阴性，说明实施例1的方法较对比例1相比，操作过程更安全，不易污染。
[0109]
可见，本发明提供的外周血单个核细胞分离方法较对比例1传统的ficoll法更优，具有操作简单、操作时间短、对细胞损伤小、低污染风险、回收率高的优点。
[0110]
在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详细描述的部分，可以参见其他实施例的相关描述。
[0111]
以上所述，为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。