一种检测呼吸道病毒用引物、crRNA、试剂盒及方法

本发明属于核酸检测，具体涉及一种检测呼吸道病毒用引物、crrna、试剂盒及方法。

背景技术：

1、呼吸道感染(respiratory tract infection，rti)是导致人类急性和致死性疾病的主要原因之一，可以在任何性别、年龄和地域中发生，所造成的疾病负担也高于其它原因所造成的疾病。世界卫生组织(world health organization，who)最新公布数据显示，下呼吸道感染在全球主要死亡原因中位列第四位，2019年260万人死于呼吸道感染，相较于2000年减少了46万人，虽然近十年来死亡人数大幅度下降，但是危害依然严峻。

2、病毒感染是引发rti的一个非常重要的原因，大约80％的rti都是由病毒引起的，在发达国家急性病毒性呼吸道感染是婴幼儿和儿童住院的首位原因，在发展中国家急性病毒性呼吸道感染是主要的死亡原因。呼吸道病毒是指一类能侵犯呼吸道引起呼吸道局部病变或仅以呼吸道为入侵门户，主要引起呼吸道组织器官病变的病毒。典型的呼吸道病毒包括甲型流感病毒(influenza a virus，fluav)、乙型流感病毒(influenza b virus，flubv)、人类冠状病毒nl63(human coronavirus nl63，hcov-nl63)、人类冠状病毒oc43(human coronavirus oc43，hcov-oc43)、人类冠状病毒hku1(human coronavirus hku1，hcov-hku1)、呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus，hrsv)、新型冠状病毒(sars-cov-2)、人类副流感病毒血清3型(human parainfluenza virus serotype 3，hpiv-3)以及人偏肺病毒(human metapneumovirus，hmpv)等。

3、呼吸道病毒大多以气溶胶和空气飞沫的形式进行传播，传染性很强，患者主要表现为发热、咳嗽和流涕等上呼吸道感染症状，病情较轻且可自愈。但同时，也有一些呼吸道病毒所导致的疾病，传染性和致死性很高，患者表现为下呼吸道感染，并诱发毛细支气管炎、肺炎和哮喘等疾病，甚至导致全身多器官衰竭。由于患者感染后的临床表征、生化指标都很相似，因此鉴别诊断十分困难。除此之外，约5％～10％的患者存在多种呼吸道病毒的混合感染，给病原学诊断带来了难度。因此，早期对感染病毒，尤其是那些传染性强，容易导致重症rti的病毒进行快速准确地鉴定，同时通过多重病原检测迅速筛查大量致病原，能够为临床治疗提供最佳的干预时机，减少抗生素滥用，还可以通过相应的预防措施抑制病毒的传播，为疾病治疗、流行病学调查及疫情控制提供有力的支持。

4、近年来，基于核酸的人类呼吸道病毒检测方法不断涌现和发展，新型冠状病毒(sars-cov-2)的暴发更促进了一些新技术的产生。重组酶聚合酶扩增技术(recombinasepolymerase amplification，rpa)是近些年兴起的一种核酸恒温扩增技术，只需在37℃左右、15分钟条件下就可以将单分子浓度水平的核酸扩增到现有手段可以检测到的浓度水平。而且，该技术对硬件设备的要求很低，所以在致病菌、病毒等微生物的检测中发挥着重要的作用。然而，虽然rpa的扩增方式较为简单，但是由于rpa是新兴技术，不像pcr有专业的软件去设计引物，目前还没有对应的软件去协助设计引物，因此它的引物设计常常会存在失败的风险。但是，rpa引物设计也有一些业内普遍认可的经验：引物长度为一般30-35nt；5’端的3-5个核苷酸应当避免聚鸟嘌呤，3’末端的3个核苷酸如果为鸟嘌呤和胞嘧啶有助于聚合酶的稳定结合，可以提升引物的扩增性能；引物中最好不要出现长串的聚嘌呤或聚嘧啶，gc含量过高(>70％)或过低(<30％)都不利于rpa扩增；此外，引物设计时应当尽量避免二级结构的形成、引物-引物互作、发夹结构的序列等，尽量减少引物二聚体的形成。然而，即使有上述引物设计规则的指导，效果良好的引物主要靠大量的合成与筛选，尤其是检测多靶标核酸的时候，更需要较多的测试才能确保每一个靶标都能被成功扩增。发明rpa技术的公司在它们的产品(dna扩增试剂盒)分析设计手册中指出：“不同序列的寡核苷酸在反应中有不同的表现，但没有固定的规则可根据核苷酸的顺序和组成来预测特定扩增引物的性能”，“即使寡核苷酸序列的微小变化有时也会导致引物活性出现显著变化”。可见，要获得扩增效果好的rpa引物必须经过诸多尝试。

5、要想实现rpa多靶标(>4个)扩增和检测，还需要克服许多的困难。除了上述引物设计和靶标区域选择，在进行多靶标扩增时还需要注意rpa反应的引物总量；只要反应中使用两对以上的扩增引物，就应该对不同引物的量进行控制和优化，否则易出现引物二聚体导致扩增失败。

6、最近研究表明，clustered regularly interspaced short palindromicrepeats(crispr)技术可用于病原的低成本、便携式的分子检测。crispr以及crisprassociated genes(cas)基因是细菌抵御外源病毒感染的免疫系统。crispr的模块特性使得此技术被广泛应用于基因组工程中。基于crispr的病原核酸的分子诊断依赖于cas核酸酶的rna或dna的靶向活性。此外，基于crispr-cas12a的病原检测技术，已经有多种体外检测的方法被开发出来(biosensors and bioelectronics，2021，187，113292；naturereviews molecular cell biology，2019，20,490)，均表明这种方式具有灵敏度高、检测精准、操作方便等优点；进一步将其与恒温扩增等技术结合，可以在非实验室环境实现对靶标核酸低至10-18m水平的检测。不过这些研究主要针对一种病毒或者细菌，面对复杂多变的现实需求，多靶标核酸检测具有更加重要的意义。对于多靶标的检测，尤其是靶标序列比较接近的亚型，在设计crrna时也需要特别注意，以避免针对一种亚型而设计的crrna交叉识别另外一种亚型，造成错误的检测。因此，针对呼吸道病毒的crrna设计既要满足识别对应病毒一些要求，也需要保证其高度的特异性，不会错误识别其他的病毒，需要克服一定的困难以达到预期目标。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对现有技术存在的上述问题，提供一种不依赖于大型检测仪器、在温和条件下即可实现多种呼吸道病毒检测、特异性和灵敏度均较高的检测呼吸道病毒用引物、crrna、试剂盒及方法。

2、为实现以上目的，本发明的技术方案如下：

3、一种扩增呼吸道病毒的核酸的rpa引物组合，所述呼吸道病毒包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、人类冠状病毒nl63、人类冠状病毒oc43、人类冠状病毒hku1、呼吸道合胞病毒、新型冠状病毒、人类副流感病毒血清型3、人偏肺病毒；

4、其中，扩增甲型流感病毒的核苷酸序列如seq id 1-2所示，扩增乙型流感病毒的核苷酸序列如seq id 3-4所示，扩增人类冠状病毒nl63的核苷酸序列如seq id 5-6所示，扩增人类冠状病毒oc43的核苷酸序列如seq id 7-8所示，扩增人类冠状病毒hku1的核苷酸序列如seq id 9-10所示，扩增呼吸道合胞病毒的核苷酸序列如seq id 11-12所示，扩增新型冠状病毒的核苷酸序列如seq id 13-14所示，扩增人类副流感病毒血清3型的核苷酸序列如seq id 15-16所示，扩增人偏肺病毒的核苷酸序列如seq id 17-18所示。

5、一种检测呼吸道病毒的crrna组合，其中，检测甲型流感病毒的核苷酸序列如seqid 19所示，检测乙型流感病毒的核苷酸序列如seq id 20所示，检测人类冠状病毒nl63的核苷酸序列如seq id 21所示，检测人类冠状病毒oc43的核苷酸序列如seq id 22所示，检测人类冠状病毒hku1的核苷酸序列如seq id 23所示，检测呼吸道合胞病毒的核苷酸序列如seq id 24所示，检测新型冠状病毒的核苷酸序列如seq id 25所示，检测人类副流感病毒血清3型的核苷酸序列如seq id 26所示，检测人偏肺病毒的核苷酸序列如seq id 27所示。

6、一种检测呼吸道病毒的试剂盒，包括前述rpa引物组合和crrna组合。

7、所述试剂盒还包括cas12a蛋白、报告分子，所述报告分子为单链dna、dna发夹结构、dna g-三链体、dna g-四链体中的一种。

8、所述试剂盒还包括多通道微流控芯片，所述微流控芯片的中心处开设有进样孔，微流控芯片的外周开设有多个出口孔，所述进样孔通过多个微通道与出口孔连通。

9、所述试剂盒还包括扩增反应液和酶切缓冲液。

10、一种检测呼吸道病毒的试剂盒的检测方法，包括：先利用所述rpa引物组合对待测样本进行扩增，然后将rpa扩增产物、cas12a蛋白、报告分子与crrna组合混合后进行酶切反应，再根据报告分子的荧光信号变化来判断呼吸道病毒的种类。

11、扩增时，所述rpa引物组合的总浓度为0.5-1.5μm。

12、所述试剂盒还包括多通道微流控芯片，所述微流控芯片的中心处开设有进样孔，微流控芯片的外周开设有多个出口孔，所述进样孔通过多个微通道与出口孔连通；

13、所述cas12a蛋白、报告分子和crrna组合预加载在出口孔上，待测样本、rpa引物组合由进样孔注入并分流至各出口孔，与cas12a蛋白、报告分子和crrna组合混合后同时进行扩增和酶切反应。

14、所述扩增温度为37-40℃，时间为15-25分钟；

15、所述酶切反应的温度为36-38℃，时间为15-20分钟。

16、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

17、1、本发明提供了一种扩增呼吸道病毒的核酸的rpa引物组合，其针对甲型流感病毒、乙型流感病毒、人类冠状病毒nl63、人类冠状病毒oc43、人类冠状病毒hku1、呼吸道合胞病毒、新型冠状病毒、人类副流感病毒血清3型、人偏肺病毒这9种不同的呼吸道病毒，利用rpa这一恒温扩增技术，无需复杂的pcr仪，仅需简单的加热装置在温和的条件下进行多靶标的扩增，既可有效扩增出对应的亚型片段，又不会交叉扩增出非目标的亚型。因此，本发明不依赖于大型检测仪器，在温和条件下即可实现多种呼吸道病毒的特异性检测。

18、2、本发明提供了一种检测呼吸道病毒的crrna组合，其针对靶标序列设计crispr-cas12a的crrna组合，利用crrna对靶标的特异性识别，可以进一步提高检测的特异性，同时cas12a蛋白通过剪切报告分子实现放大信号的效果，使得灵敏度和特异性都得到了很大的提高。因此，本发明具有较高的特异性和灵敏度。

19、3、本发明提供了一种检测呼吸道病毒的试剂盒，该试剂盒包括rpa引物组合、crrna组合以及多通道微流控芯片，微流控芯片的中心处开设有进样孔，微流控芯片的外周开设有多个出口孔，进样孔通过多个微通道与出口孔连通，cas12a蛋白、报告分子和crrna组合可预加载在出口孔上，待测样本、rpa引物组合由进样孔注入并分流至各出口孔，与cas12a蛋白、报告分子和crrna组合混合后同时进行扩增和酶切反应，与先扩增再检测的常规核酸检测流程相比，通过使扩增和检测反应同时在芯片上进行有利于简化操作，缩短检测时间，同时，cas12a蛋白和crrna组合可预先加载在出口孔中并冻干，从而方便存储、运输和现场使用。因此，本发明不仅有效简化了操作，缩短了检测时间，而且便于运输和使用。