一株耐盐碱柠檬酸杆菌及其在促进植物生长中的应用

1.本发明属于微生物领域，具体涉及一株耐盐碱柠檬酸杆菌及其在促进植物生长中的应用。


背景技术：

2.土壤盐碱胁迫是制约植物生长和发育的重要非生物因素之一，也是限制农业发展和威胁生态环境保护的严峻问题之一。目前世界上大约有20％的灌溉土受盐碱胁迫的影响，且面积逐年增长，盐碱程度逐年恶化，预计至2050年全球50％的耕地会发生盐碱化。而我国盐碱地面积位列全世界第三位，盐碱地改良治理工作迫在眉睫。
3.目前盐碱地的修复利用研究主要采用物理方法、化学方法和生物学方法。前两种方法虽然取得了快速的效果，但是因其成本较高因而在实际应用中难以持续，而且用化学法改良还容易造成二次污染等一系列繁杂的问题。相比之下，生物方法成本低，对环境友好，且可持续利用。
4.耐盐碱促生菌可促进植物根系生长，减缓盐碱胁迫对植物生长的不利影响，利用其可实现盐碱地改良的目的，因此属于常见的盐碱地治理的生物学方法之一。目前已从盐碱土壤中分离获得的芽孢杆菌属(bacillus)、假单胞菌属(pseudomonas)、微球菌属(micrococcus)、无色杆菌属(achromobacter)和黄杆菌属(flavobacterium)等多种耐盐碱菌属可表现出调节植物激素浓度、产生渗透调节物质、产生抗氧化防御物质等多种促生作用，在一定程度上可提高植物对高盐高碱胁迫的耐受性。
5.柠檬酸杆菌(citrobacter)曾被报道具有解磷和解钾作用，但既具有耐盐耐碱特性，又兼具解磷和固氮功能、对大豆生长有促进作用的柠檬酸杆菌属尚未报道。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一株缓解植物耐盐碱胁迫的citrobacter属促生细菌，该菌具有较强的耐盐、耐碱特性，其生长耐受的nacl浓度＞9％(w/v)，能耐受的ph值为8.0～12.0，同时还兼有溶磷和固氮功能，可以改善土壤有效磷含量，为作物生长提供更多氮源。
7.本发明是通过以下技术方案实现的：
8.本发明提供了一株从中国宁夏银川盐碱地土壤分离获得的耐盐碱促生细菌，经鉴定为：柠檬酸杆菌(citrobacter sp.)ys-at2。
9.所述的耐盐碱促生细菌ys-at2，其在lb培养基上30℃培养2d，菌落呈圆形，边缘整齐，表面光滑，略凸起，半透明，半流质，淡黄色。
10.所述的耐盐碱促生细菌ys-at2，其16s rdna序列如seq id no.1所示，该菌系统分类属于citrobacter属。
11.所述的耐盐碱促生细菌ys-at2，其生长耐受的nacl浓度＞9％(w/v，90g/l)，能耐受的ph值为8.0～12.0。
12.所述的耐盐碱促生细菌ys-at2，具有溶磷功能。
13.所述的耐盐碱促生细菌ys-at2，具有固氮功能。
14.本发明的另一目的在于可以为制备缓解植物盐碱胁迫和促进豆科作物生长的微生物菌剂或生物肥料提供候选菌株，该菌可促进盐碱胁迫下大豆种子萌发，且可促进盐碱胁迫下拟南芥生长和大豆生长。
15.所述的耐盐碱促生细菌ys-at2，在ph8.0～12.0生长条件下对ph的改变幅度为2.7％～13.8％。
16.所述的耐盐碱促生细菌ys-at2，可促进盐碱土壤中大豆早期幼苗生长。
17.所述的耐盐碱促生细菌ys-at2，可促进盐碱胁迫下的拟南芥生长。
18.所述的耐盐碱促生细菌ys-at2，可促进盐碱胁迫下的大豆生长。
19.本发明的优点和有益效果为：
20.本发明所述的耐盐碱促生细菌ys-at2可促进盐碱土壤中大豆早期幼苗生长和盐碱胁迫下的拟南芥生长，相比于已报道的该菌属其他促生菌，该菌在盐碱环境胁迫下适应性更强，同时还具有溶磷和固氮功能，不仅可适用于含盐量＞9％(w/v)的高盐土壤，还可适用于ph8.0～12.0的重度碱地，有利于一菌多用。
21.此外，本发明所述的耐盐碱促生细菌ys-at2，具有促进多种植物生长和降碱的优良特性，一方面为制备适用于盐碱地区的优质微生物促生菌肥或促生菌剂的应用提供菌种资源和理论支撑，减缓盐碱胁迫对植物生长的不利影响；另一方面可开发适用于盐碱地改良的微生物制剂，为盐碱地的改良和有效利用提供安全有效的微生物资源。
22.本发明提供了一株从中国宁夏银川盐碱地土壤分离获得的耐盐碱促生细菌：柠檬酸杆菌(citrobacter sp.)ys-at2，该菌株已进行保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北武汉市武昌区八一路珞珈山武汉大学，保藏日期：2021年3月16日，保藏编号cctcc no:m2021238。
附图说明
23.图1(a)是本发明耐盐碱促生细菌(citrobacter sp.)ys-at2在lb培养基上的菌落生长观察图；图1(b)在透射电镜(tem)下观察到的菌株形态；
24.图2是本发明耐盐碱促生细菌ys-at2的16s rdna系统发育树；
25.图3是本发明耐盐碱促生细菌ys-at2在不同nacl浓度条件下生长曲线；
26.图4是本发明耐盐碱促生细菌ys-at2在不同ph条件下生长曲线；
27.图5是本发明耐盐碱促生细菌ys-at2降碱曲线；
28.图6是本发明耐盐碱促生细菌ys-at2在解磷培养基上形成透明溶磷圈效果图；
29.图7是本发明耐盐碱促生细菌ys-at2在无氮源的培养基上生长效果图；
30.图8是本发明耐盐碱促生细菌ys-at2在盐碱土壤中促进大豆早期幼苗生长观察图；
31.图9是本发明耐盐碱促生细菌ys-at2促进盐碱胁迫环境下拟南芥生长图；
32.图10是本发明耐盐碱促生细菌ys-at2促进碱性土壤大豆生长观察图。
33.对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，可以根据以上附图获得其他的相关附图。
34.保藏信息
35.柠檬酸杆菌(citrobacter sp.)ys-at2，该菌株已进行保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北武汉市武昌区八一路珞珈山武汉大学，保藏日期：2021年3月16日，保藏编号cctcc no:m2021238。
具体实施方式
36.为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。
37.实施例一：
38.耐盐碱促生细菌柠檬酸杆菌(citrobacter sp.)ys-at2的分离纯化
39.样品来源：中国宁夏银川盐碱地土壤
40.lb培养基(固体)：胰蛋白胨10g，yeast extract 5g，nacl 10g，琼脂15g，h2o 1000ml，ph 7.0-7.2，121℃灭菌30min。
41.lb培养基(液体)：胰蛋白胨10g，yeast extract 5g，nacl 10g，h2o 1000ml，ph 7.0-7.2，121℃灭菌30min。
42.分离和纯化步骤：采集中国宁夏银川盐碱地土壤，取5g供试土壤加入装有45ml无菌水的锥形瓶中，同时加入灭菌玻璃珠便于土壤颗粒在震荡过程中能更好地散开，使微生物充分分散于无菌水中，摇床振荡30min(28℃，180r
·
min-1
)。振荡结束后进行逐级梯度稀释至10
–6，选取上述各浓度梯度菌悬液100μl涂布于nacl浓度为9％的lb固体培养基中用于细菌菌株分离。将平板倒置放入28℃恒温培养箱中培养48～72h后，从分离获得的多株菌株中选取菌落形态、颜色、粘稠度以及大小不同的菌株，反复挑取单一菌落划线培养，分别继代培养4～5代，即可得到纯的、形态一致的单菌落。
43.实施例二
44.耐盐碱促生细菌柠檬酸杆菌(citrobacter sp.)ys-at2的鉴定
45.(1)生物学鉴定
46.耐盐碱促生细菌ys-at2在lb固体培养基平板上30℃培养2d，菌落呈圆形，边缘整齐，表面光滑，略凸起，半透明，半流质，淡黄色，如图1所示。
47.(2)系统分类鉴定
48.用接种环挑取盐碱促生细菌ys-at2在lb固体培养基平板上菌落于100ml lb液体培养基中，30℃ 180rpm摇床培养24h，按照细菌基因组dna提取试剂盒(tianamp bacteria dna kit)说明提取促生细菌基因组dna，用细菌通用引物27f(5'-agagtttgatcctggctcag-3')和1492r(5'-ggctaccttgttacgactt-3')扩增得到目的基因片段。pcr反应体系采用10μl体系，体系如下：27f和1492r引物(50pmol)各0.1μl、ys-at1菌悬液0.3μl、dntp(2.5mm takara)1μl、rtaqbuffer(takara)1μl、rtaq聚合酶(5u
·
μl-1，takara)0.3μl、无菌水7.2μl，以不加菌悬液为对照。扩增条件为：94℃ 3min，94℃ 1min、55℃ 1min、72℃ 1min(28个循环)，72℃ 5min，将pcr产物提交华大基因(深圳)股份有限公司测序，测序所得菌株ys-at2的16sr dna如序列表seq no.1所述。
49.将得到的测序序列与genbank中的核酸数据进行blast(national center for biotechnology information[http://www.ncbi.nlm/nih.gov])同源性比对，并用软件
molecular evolutionarygenetic analysis software(mega 5.0)构建系统进化树，结果如图2所示，菌株ys-at2与citrobacterfreundii dsm 30039序列可构成稳定的进化分支，与citrobacterfreundii dsm 30039同源性为99.37％。
[0050]
实施例三
[0051]
耐盐碱促生细菌ys-at2耐盐、耐碱能力评价
[0052]
(1)耐盐能力评价
[0053]
在含有0、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％(w/v)nacl的lb培养基中接种种子菌液，1％接种量，30℃振荡培养48h，测定光吸收值(od600)，绘制生长曲线(图3)。不同nacl浓度培养基不接种菌液为对照组。结果显示菌株ys-at2在nacl浓度0％～9％(w/v)的lb培养基中均可生长。
[0054]
(2)耐碱能力评价
[0055]
设定以下ph梯度：8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0，用1n naoh或1n hcl调节ph值，1％接种量，30℃振荡培养48h，测定光吸收值(od600)，绘制生长曲线，如图4所示，不同ph梯度培养基不接种菌液为对照组。结果显示菌株ys-at2在ph8.0～12.0的范围内可生长。
[0056]
(3)降碱能力测定
[0057]
将保存菌株活化后以5％接种量接入到ph8.5～11.5的lb液体培养基中，48h后观察菌株生长情况并测定发酵后菌液ph值，计算如下：η＝(ph前－ph后)/ph前*100％，
[0058]
式中：η为菌株降碱能力，ph前为菌株发酵前培养基的ph值；ph后为菌株发酵后培养基的ph值，以百分比为纵坐标绘制菌株降碱率曲线，如图5所示。
[0059]
实施例四
[0060]
耐盐碱促生细菌ys-at2解磷、固氮能力评价
[0061]
(1)菌株解磷能力测定
[0062]
将保存菌株活化后接种于解磷培养基上，培养基具体成分为：1l无菌水：10g葡萄糖；0.5g酵母粉；5g ca3(po4)2；0.5g(nh4)2so4；0.1g mgso4·
7h2o；0.2gnacl；0.2g kcl；0.002g mnso4·
h2o；0.002g feso4·
7h2o；15g琼脂，置于30℃培养箱培养3天，观察菌落周围是否有透明圈，如有，说明菌株具有解磷功能，结果如图6所示，说明菌株有解磷功能。
[0063]
(2)菌株固氮能力测定
[0064]
将保存菌株活化后接种于固氮培养基上，培养基具体成分为：1l无菌水，20g甘露醇，2.0g caco3；1.0g k2hpo4；0.5g mgso4·
7h20；0.5g nacl；0.1g feso4；0.005gna2moo4；17g琼脂，ph 7.4
±
0.02。因培养基中不含有氮源，因此能在上述培养基上生长即可判断为具有固氮能力，如图7箭头所示为菌株citrobacter sp.ys-at2。
[0065]
实施例五
[0066]
耐盐碱促生细菌ys-at2促进大豆早期幼苗在盐碱胁迫条件下生长
[0067]
将ys-at2菌株接种于lb液体培养基中，28℃振荡培养24h后，4℃离心收集菌体，用无菌水洗涤2次后重悬于无菌水中，在600nm处用无菌水调整菌悬液od值为1.0，大豆种子用去离子水清洗表面，75％酒精消毒5min后，用无菌水冲洗5次。室温下，将种子浸于菌悬液中过夜，置于无菌种子培养袋中，以无菌水浸泡大豆种子过夜为对照。培养袋中分别加入15mlh2o，15mlnacl(50mm、100mm、100mm)和15mlnahco3(50mm、100mm、100mm)溶液，定期加入
无菌水溶液保证大豆种子生长，28℃恒温培养5d后，结果显示，菌株ys-at2具有促大豆种子萌发作用，可促进早期幼苗在盐碱胁迫条件下生长，如附图8所示，citrobacterys-at2在不同盐碱条件下对大豆早期幼苗生长的促生效果图。图中，每个ph条件下左侧为不接菌处理，右侧为用1od的citrobacterys-at2菌液浸种处理。
[0068]
实施例六：
[0069]
耐盐碱促生细菌ys-at2促进碱胁迫下的拟南芥生长
[0070]
将ys-at2菌株接种于lb液体培养基中，28℃振荡培养24h后，获得菌悬液。在ph为9.5的1/2ms培养基平板中一侧接种拟南芥种子，4℃避光放置3d后，于另一侧接种10μl菌悬液，30℃光照培养箱观察7d。结果显示，菌株ys-at2可促进碱性条件下拟南芥生长，如附图9所示接种citrobacterys-at2的拟南芥在ph 9.5的ms培养基中培养7天后的表型。
[0071]
实施例七：耐盐碱促生细菌ys-at2促进盐碱条件下大豆生长
[0072]
将ys-at2菌株接种于lb液体培养基中，28℃振荡培养48h后，获得菌悬液。将菌悬液离心，向其中加入无菌水，在od
600
条件下，制成od值为1的菌悬液，用该菌悬液浸泡大豆种子过夜，同时，以无菌水浸泡种子作为对照，第二天将对照种子和用菌液浸泡的种子播种在ph8.2/ec 450μs
·
cm-1
的碱性土壤中，三次重复，在幼苗生长的第14天，向浸种处理的幼苗生长盆中浇灌40ml od
600
＝1的菌液，于幼苗生长第24天收获大豆地上植株和根部，测量地上部分株高、鲜重和干重，以及地下部分根长。结果显示，菌株ys-at2可促进盐碱条件下大豆生长，如附图10所示和表1所示。
[0073]
表1菌株ys-at2对大豆的促生作用
[0074][0075]
实施例七：耐盐碱促生细菌ys-at2耐盐碱机理
[0076]
将ys-at2菌株接种于lb液体培养基中，28℃振荡培养72h后，获得菌悬液。将菌悬液离心，弃掉上清后用无菌水洗涤再次离心，弃掉上清，获得纯净的菌体，然后按照基因组dna纯化试剂盒(promega)说明书对菌体进行基因组dna提取。纯化的基因组dna采用tbs-380荧光仪(turner biosystems inc.，sunnyvale，ca)进行定量。高质量的dna(od260/280＝1.8～2.0，dna总量≥5μg，浓度≥60ng/μl)用于建库测序，具体的测序委托华大基因完成。测序结束后，根据kegg和cog对基因功能进行比对注释后，以文献报道的嗜盐、嗜碱和耐热机制密切相关的基因为关键词进行检索，发现菌株ys-at2含有甘氨酸/甜菜碱转运体(glycine betaine/l-proline abc transporter)、钠转运体(sodium/glutamate symporter)、谷胱甘肽调节的钾外流系统(glutathione-regulatedpotassium-efflux system ancillary protein kefg)、trk系统钾转运体(trk system potassium transporter trka)、钾转运atp酶(potassium-transportingatpase subunit kdpa)、逆向转运体(如hexose-6-phosphate:phosphate antiporter、na(+)/h(+)antiporter nhab、sodium-potassium/proton antiporter chaa和na
+
/h
+
antiporternhaa等)以及热休克蛋白
(heat shock chaperone ibpa/b)等。基因统计数据如表2所示。以上说明菌株ys-at2在盐碱环境下仍然能够促进作物生长的机理即：通过自身细胞对盐碱性物质的运输、对钠钾离子的转运和调节、生成热休克蛋白以及高浓度溶质来防止蛋白质变性/改变蛋白质构造，进而维持体内外的渗透压来抵御外界高盐碱环境，保证自身的生命活动功能不受影响，在盐碱条件下仍然能够发挥解磷、固氮等功能，促进作物生长。
[0077]
表2基因统计表
[0078]
[0079]
[0080][0081]
以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。
[0082]
ys-at2，其16s rdna序列seq id no.1，如下：
[0083]
》citrobacterys-at2
[0084]
tgctcagattgaacgctggcggcaggcctaacacatgcaagtcgaacggtagcacagaggagcttgctccttgggtgacgagtggcggacgggtgagtaatgtctgggaaactgcccgatggagggggataactactggaaacggt
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