一株贝莱斯芽孢杆菌1-3、菌株同时产2类抗菌物质的方法及其所产抗菌物质和用途与流程

本发明属于微生物，具体涉及一株贝莱斯芽孢杆菌1-3、贝莱斯芽孢杆菌1-3同时产生两类抗菌物质的方法、及其所产的抗菌物质和用途。

背景技术：

0、技术背景

1、在全世界范围内，抗生素在医疗、畜牧等行业不规范使用引起的一系列食品、卫生和环境问题，严重威胁人类的健康。据世界卫生组织(world health organization，who)估计，在许多国家，50％以上的抗生素属于不当使用的范畴，其中最主要的是抗生素作为生长促进剂在畜牧养殖行业中的应用。

2、长期使用抗生素的灾难性后果包括：

3、1.抗生素作为促生长剂长期饲喂动物，导致动物源性食品和环境中抗生素残留问题日趋严重，抗生素残留进一步通过食物链向上传导，进而富集到人体内，更加剧了对人类健康的威胁。

4、2.更为严重的是抗生素的不规范使用导致细菌产生抗药性，而兽用抗生素耐药菌在传播过程中又面临人用抗生素的二次筛选，最终形成了对所有抗生素均具有抗性的“超级细菌”。

5、因此发掘抗菌机制有别于抗生素的新型抗菌物质才是解决病原菌内药性的根本手段。

6、另外，全世界每年农副产品、果蔬等食品及其原料因腐烂变质而引起的经济损失十分巨大。因此，延长它们的保质期是食品工业的一项重要任务，而添加防腐剂是防止食品腐败变质的重要方法。目前化学防腐剂如苯甲酸钠、山梨酸钾等依然在我国防腐剂市场上占有很大的份额，而化学防腐剂或多或少的对人体会有一定的毒副作用。随着生活水平的提高和保健意识的增强，人们对食品安全的关注度越来越高。天然、绿色、安全的生物防腐剂将占据更大的市场，并逐渐取代传统的化学防腐剂。生物防腐剂按照来源分为植物来源防腐剂、动物来源的防腐剂及微生物来源的防腐剂。其中微生物防腐剂主要以天然农产品为原料，通过发酵方法制得，具有安全无毒、适用性广、性能稳定和易于工业化生产等优点。

7、表面活性剂能降低溶剂表面张力和界面能量，因此具有强烈的去污能力，在处理被石油污染的土壤、水体等方面有着广泛的应用。然而，化学合成的表面活性剂通常具有毒性、热稳定性差等缺点，在治理环境的同时又引入的新的污染源。生物表面活性剂是微生物或植物在一定条件下培养时，其代谢过程中分泌出的具有一定表界面活性，集亲水基和疏水基结构于一分子内部的两亲化合物，如糖脂、多糖脂、脂肽或中性类脂衍生物等。它无毒，可以生物降解，对环境影响很小，热稳定性和化学稳定性较好，具有高效的表面活性，是合成表面活性剂的理想代替品。

技术实现思路

1、本发明提供了一株贝莱斯芽孢杆菌1-3，及贝莱斯芽孢杆菌1-3同时产生两类抗菌物质的方法及其所产抗菌物质的方法和用途。所述贝莱斯芽孢杆菌1-3可以同时产生2类不同的抑菌活性物质，并对多种病原菌具有很好的抑制作用，其提取得到的2类抗菌物质具有很好的抗菌活性，另一方面，抗菌物质2还具有清除油污的作用。

2、为实现上述发明目的，本发明通过下述技术方案予以实现：

3、本发明提供了一株口腔来源的贝莱斯芽孢杆菌菌株1-3，其分类命名为贝莱斯芽孢杆菌bacillus velezensis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.25292。

4、所述贝莱斯芽孢杆菌1-3菌落为圆形、白色，表面微凸、呈微褶皱状、无光泽、不透明，边缘明显清晰，菌落周围具有较宽的透明圈，菌体呈杆状。

5、进一步的，所述贝莱斯芽孢杆菌菌株1-3的16s rrna序列如seq id no.1所示。

6、另一方面，本发明提供了贝莱斯芽孢杆菌菌株1-3同时产生2类具有抑菌活性物质的方法，所述方法包括如下步骤：

7、(1)取贝莱斯芽孢杆菌1-3进行深层液体发酵；；

8、(2)分离纯化：

9、a.将(1)获得的发酵液离心，取发酵上清液经大孔树脂吸附；

10、b.吸附后的大孔树脂用2-5倍体积的蒸馏水洗，再依次用2-5倍体积的30％、

11、75％、95％浓度的乙醇洗脱，收集洗脱液；

12、c.将洗脱液于40-42℃的条件下旋转浓缩；将获得的浓缩液经冷冻、真空干燥后，得到粗提物；

13、d.对粗提物分别以75％的乙醇洗脱、并通过g-50分子筛凝胶层析纯化获得抗菌物质1，以95％的乙醇洗脱、并通过g-50分子筛凝胶层析纯化获得抗菌物质2。

14、进一步的，所用tsb-ye培养基为：可溶性淀粉15-18g/l，葡萄糖5-10g/l，酵母提取物15-20g/l，nacl 8-12g/l，mg2+浓度0.8-1.2mmol。将所述贝莱斯芽孢杆菌1-3接种于培养基中，37℃，180rpm条件下培养12小时得到种子液。按照2％将种子液的接种量接种到含有25l发酵培养基50l发酵罐中。

15、进一步的，所述方法中贝莱斯芽孢杆菌菌株1-3进行深层液体发酵时，条件如下：初始ph 6.0-8.0，装料量40％-80％，接种量1％-15％，培养温度30-40℃，通风为1:0.4～1:1.2，转速为100-400rpm，发酵时间24-72小时。

16、将发酵液离心，将发酵上清液与经预处理的大孔吸附树脂按5-10:1(v/m)的比例进行动态吸附，流速为1-2bv/h，在室温条件下吸附18-24h至发酵液被完全吸附；吸附后的废液以2-3bv的体积依次用2-5倍体积的蒸馏水、2-5倍体积的30％、75％、95％的乙醇进行梯度洗脱，控制流速为1-2bv/h，收集不同浓度的洗脱液；将不同区分洗脱液于40-42℃的条件下旋转蒸发浓缩，去除乙醇；将去除乙醇后的洗脱液经真空冷冻干燥，在75％乙醇洗脱区分得到了抗菌物质1，从95％乙醇区分中得到了抗菌物质2。

17、进一步的，所述步骤(2)分离纯化时发酵上清液与大孔树脂体积比为5-20:1。

18、所述方法获的抗菌物质的提取效率高，通过tricine-sds-page电泳检测，可以实现100％的抑菌活性物质的吸附，可以通过75％的乙醇洗脱可以实现85％-95％抗菌提取物1的分离，通过95％的乙醇洗脱可以实现95％-100％抗菌提取物2的纯化。另一方面，本发明提供了一种贝莱斯芽孢杆菌1-3产生的抗菌物质1，其特征在于，所述抗菌物质1为细菌素，抗菌物质其蛋白质序列如seq id no.2所示。

19、进一步的，通过g-50分子筛凝胶层析对抗菌物质1进行纯化，在280nm下得到单一吸收峰，冷冻干燥后得到抗菌物质1。

20、进一步的，通过tricine-sds-page电泳检测，估算抗菌物质1粗品的分子量为7.0-7.5kda，通过质谱抗菌物质1分子量为7351.405da，并含有一段nasfahaaw的序列。将该序列同贝莱斯芽孢杆菌1-3的转录组序列进行比对，发现其序列对应于转录组中唯一一条蛋白，而且序列完全一致。

21、进一步的，将所述蛋白序列定位到贝莱斯芽孢杆菌1-3基因组上，并从贝莱斯芽孢杆菌1-3基因组中克隆出相关基因，并翻译为蛋白序列，分子量为7369.63da。

22、进一步的，将翻译的蛋白序列进行序列比对，发现其属于环状细菌素，即肽链首尾氨基酸残基通过肽键连接后，形成环状结构。

23、进一步的，肽链首尾氨基酸残基通过肽键连接后会失去一个水分子。

24、进一步的，翻译的蛋白序列分子量推测7369.63da，若减去环化过程丢失的一个水分子，分子量应为7351.63，与一级质谱直接测定的抗菌物质1的分子量7351.405da完全相同(小数点后的分子量差异系同位素不同计入所导致)。

25、进一步的，所述抗菌物质1可以耐受80℃以下的高温处理。

26、进一步的，所述抗菌物质1可以耐受ph4.0以上的环境条件。

27、进一步的，所述抗菌物质1可以耐受胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶k、木瓜蛋白酶、糜蛋白酶的降解。

28、另一发明，本发明提供了一种本发明还提供了贝莱斯芽孢杆菌1-3产生的抗菌物质2。

29、通过g-50分子筛凝胶层析对抗菌物质2进行纯化，在280nm下得到检测吸收峰，冷冻干燥后得到抗菌物质2。

30、进一步的，所述抗菌物质2为环状脂肽。

31、进一步的，所述抗菌物质2的序列特征为：n端-llvdlle-c端，所述环肽的n端和c端通过肽键相连，形成了环状结构。

32、进一步的，通过薄层层析后碘染色发现抗菌物质2中含有脂肪链和肽链，是一种脂肽结构。

33、进一步的，发现抗菌物质2含有三个特征峰，分子量相差14，即一个ch2。通过二级质谱鉴定和解析，确定三个特征峰的结构为由一个环肽结构和三种c原子数不同的脂肪链连接形成的脂肽结构。

34、进一步的，三种c原子数不同的脂肪链含有的碳原子数分别为14、15和16个。通过质谱分析，发现抗菌物质2含有三个信号峰，分子量分别为1030.642da、1044.660da和1058.677da。

35、另一方面，本发明还提供了所述的贝莱斯芽孢杆菌菌株1-3所产生的抗菌物质1和抗菌物质2在用于制备抑制病原菌的抗菌剂、食品防腐剂和环境治理产品中的用途。

36、进一步的，所述病原菌包括单细胞核增生李斯特菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、缓慢葡萄球菌、粪肠球菌、蜡样芽胞杆菌、大肠杆菌、溶藻弧菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、嗜水气单胞菌、溶血不动杆菌、阪崎肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、立枯丝核菌、植物炭疽病菌、杂色曲霉。

37、进一步的，所述抗菌物质1可通过降低单核增生李斯特菌的增殖速度。

38、进一步的，所述抗菌物质1对单核增生李斯特菌的增殖的最小抑菌浓度为2μg/ml。

39、进一步的，所述抗菌物质1对单核增生李斯特菌的抑菌机理为破坏其细胞膜结构，导致胞内k+和蛋白外流。

40、进一步的，所述抗菌物质1可以抑制单核增生李斯特菌生物被膜的形成。

41、另一方面，本发明还提供了所述的贝莱斯芽孢杆菌菌株1-3所产生的抗菌物质2在作为清除油渍的表面活性剂的用途。

42、进一步的，所述抗菌物质2作为表面活性剂在石油采油、页岩采油、洗涤、环境改良、土壤清除油渍上的用途。

43、进一步的，在应用时，抗菌物质2不低于0.16mg/ml时，具有清除油污的作用。

44、与现有技术相比，本发明具有以下优点和技术效果：

45、1)本发明提供了一株口腔来源的贝莱斯芽孢杆菌菌株1-3，该菌株能够同时产生2类抗菌物质。

46、2)本发明确定了菌株1-3同时产生2类抗菌活性物质的深层液体发酵生物合成方法，同时建立了大孔树脂吸附及分离抗菌活性物质的方法，该方法提取效率高，可达成100％吸附，随之，通过75％的乙醇洗脱可以实现85％-95％抗菌提取物1的分离，通过95％的乙醇洗脱可以实现95％-100％抗菌提取物2的分离。

47、3)本发明获得的2类抑菌活性物质，抗菌物质1为细菌素，其分子量为7351.405da，可耐受80℃以下的高温、ph4.0的环境，并可耐受胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶k、木瓜蛋白酶、糜蛋白酶的降解；抗菌物质2为由一个环肽结构和三种c原子数不同的脂肪链连接形成的脂肽结构。

48、4)本发明提供了抗菌物质1和抗菌物质2在抑制病原菌的抗菌剂、食品防腐剂和环境治理产品中的用途。具体的对单细胞核增生李斯特菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、缓慢葡萄球菌、粪肠球菌、蜡样芽胞杆菌、大肠杆菌、溶藻弧菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、嗜水气单胞菌、溶血不动杆菌、阪崎肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、立枯丝核菌、植物炭疽病菌、杂色曲霉等病原菌具有抑菌活性。

49、5)本发明提供了抗菌活性的为破坏细菌的细胞膜结构。

50、6)本发明抗菌物质2同时具有清除油污的作用。