一种黄连蛋白及其用作递送药物的纳米载体

0.3μm，更佳地0.18-0.25μm，最佳地0.22μm。
17.优选地，所述的步骤(2)中，所述的透析的截留分子量为2500-4500da，较佳地3000-4000da，更佳地3200-3800da，更佳地3400-3600da，最佳地3500da。
18.优选地，所述的步骤(2)中，透析分离后进行冷冻干燥得到所述黄连蛋白。
19.优选地，所述的步骤(2)中，所述黄连蛋白的分子量为20-40da，较佳地25-35da，更佳地22-30da，更佳地26-27da，最佳地28da。
20.本发明第二方面提供一种如本发明第一方面所述的黄连蛋白的用途，用于制备递送药物的纳米载体。
21.优选地，所述纳米载体负载药物。
22.优选地，所述纳米载体为纳米颗粒。
23.优选地，所述纳米颗粒为纳米粒。
24.优选地，所述药物包括多西他赛。
25.本发明第三方面提供一种载药纳米颗粒，所述的载药纳米颗粒包括如本发明第一方面所述的黄连蛋白和药物。
26.优选地，所述黄连蛋白作为纳米颗粒的载体负载药物。
27.优选地，所述的纳米颗粒为纳米粒。
28.优选地，所述的药物包括多西他赛。
29.本发明第四方面，提供一种制备如本发明第三方面所述载药纳米颗粒的方法，所述的方法包括步骤：
30.(a)将黄连蛋白溶解于水中，得到黄连蛋白水溶液，调节黄连蛋白水溶液的ph，得到黄连蛋白溶液；
31.(b)将药物加入到步骤(a)的所述黄连蛋白溶液中，搅拌得到载药纳米颗粒。
32.优选地，所述步骤(a)中，所述的黄连蛋白水溶液中，所述黄连蛋白浓度为0.8-1.2mg/ml，较佳地1.0mg/ml。
33.优选地，所述步骤(a)中，调节黄连蛋白水溶液ph至9-11，较佳地9.5-10.5，更佳地10。
34.优选地，所述步骤(a)中，用氢氧化钠水溶液调节ph。
35.优选地，所述氢氧化钠水溶液的浓度为0.1-0.3mm，较佳地0.2mm。
36.优选地，所述步骤(b)中，所述的药物包括多西他赛乙醇溶液形式。
37.优选地，所述多西他赛乙醇溶液中，所述多西他赛的浓度为20-40mg/ml，较佳地25-35mg/ml，更佳地28-32mg/ml，最佳地30mg/ml。
38.优选地，所述多西他赛乙醇溶液与所述黄连蛋白溶液的体积比为1:80-120，较佳地1:90-110，更佳地1:95-105，最佳地1:97-102。
39.优选地，所述步骤(b)中，所述搅拌的温度为15-30℃，较佳地18-24℃，更佳地22℃。
40.优选地，所述步骤(b)中，所述搅拌的时间为10-14h，较佳地11-13h，更佳地12h。
41.优选地，所述步骤(b)中，所述搅拌在避光条件下进行搅拌。
42.优选地，所述步骤(b)中，所述的搅拌后经离心处理。
43.优选地，所述的离心除去团块。
44.优选地，所述的步骤(b)中，所述离心力为5000-15000g，较佳地8000-12000g，更佳地9000-11000g，最佳地10000g。
45.优选地，所述的步骤(b)中，所述离心的时间为5-15min，较佳地8-12min，更佳地10min。
46.本发明第五方面，提供一种组合物，所述的组合物包括如本发明第三方面所述的载药纳米颗粒。
47.优选地，所述的组合物为药物组合物。
48.优选地，所述的药物组合物还包括药学上可接受的载体。
49.优选地，所述的组合物为固体制剂、液体制剂或半固体制剂。
50.优选地，所述的组合物为注射制剂、口服制剂或外用制剂。
51.优选地，所述的组合物的剂型为口服溶液剂。
52.优选地，所述的注射制剂为静脉注射制剂、动脉注射制剂、瘤内注射制剂、肿瘤血管内注射制剂或肿瘤微环境注射制剂。
53.本发明第六方面，提供一种如本发明第三方面所述的载药纳米颗粒的用途，用于制备预防和/或治疗疾病的组合物。
54.优选地，所述的疾病为药物的适应症疾病。
55.优选地，所述的药物包括抗癌药物。
56.优选地，所述的药物包括多西他赛。
57.优选地，所述疾病包括肿瘤。
58.优选地，所述的组合物为药物组合物。
59.优选地，所述的药物组合物还包括药学上可接受的载体。
60.优选地，所述的组合物为固体制剂、液体制剂或半固体制剂。
61.优选地，所述的组合物为注射制剂、口服制剂或外用制剂。
62.优选地，所述的组合物的剂型为口服溶液剂。
63.优选地，所述的注射制剂为静脉注射制剂、动脉注射制剂、瘤内注射制剂、肿瘤血管内注射制剂或肿瘤微环境注射制剂。
64.本发明第七方面，提供一种预防和/或治疗疾病的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：
65.在给所需的对象施用如本发明第三方面所述的的载药纳米颗粒或如本发明第五方面所述的组合物，从而预防和/或治疗疾病。
66.优选地，所述的疾病为药物的适应症疾病。
67.优选地，所述的药物包括抗癌药物。
68.优选地，所述的药物包括多西他赛。
69.优选地，所述疾病包括肿瘤。
70.优选地，所述的对象包括人或非人哺乳动物。
71.优选地，所述的非人哺乳动物为小鼠、大鼠、兔、猴、牛、马、羊、狗、猫、猩猩或狒狒。
72.优选地，所述的施用为注射施用、口服施用或外用施用。
73.优选地，所述注射施用为静脉注射施用、动脉注射施用、瘤内注射施用、肿瘤血管内注射施用或肿瘤微环境注射施用。
74.优选地，所述静脉注射施用为上肢静脉施用或下肢静脉施用。
75.在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。
附图说明
76.图1为多西他赛纳米粒(nnps-dtx)中多西他赛与游离多西他赛(dtx)溶解性的差异(mean
±
sd，n＝3).**，p《0.01vs dtx。
77.图2为多西他赛纳米粒(nnps-dtx)中多西他赛与游离多西他赛(dtx)在人工胃液(a)及人工肠液(b)中溶出的差异(mean
±
sd，n＝3).**，p《0.01vs dtx。
78.图3为灌胃给药后纳米粒(nnps-dtx)中多西他赛与游离多西他赛(dtx)在大鼠体循环中的药时曲线(mean
±
sd，n＝5)。
具体实施方式
79.本发明开发一种黄连蛋白，所述的黄连蛋白用作递送药物的纳米载体能够显著提高多西他赛的溶解性、溶出速率和口服生物利用度，从而提高多西他赛口服应用价值。
80.术语
81.如本文所用，术语“包括”、“包含”与“含有”可互换使用，不仅包括开放式定义，还包括半封闭式、和封闭式定义。换言之，所述术语包括了“由
……
构成”、“基本上由
……
构成”。
82.如本文所用，多西他赛的英文为docetaxel。
83.如本文所用，黄连的拉丁文为coptis chinensis franch。
84.在本发明中，术语“预防”表示预防疾病和/或它的附随症状的发作或者保护对象免于获得疾病的方法。本文中使用的"预防"还包括延迟疾病和/或它的附随症状的发作和降低对象的得病的风险。
85.在本发明中，术语“治疗”包括延缓和终止疾病的进展，或消除疾病，并不需要100％抑制、消灭和逆转。
86.黄连蛋白
87.本发明提供一种黄连蛋白，所述的黄连蛋白通过以下方法制备：
88.(1)用水对黄连进行提取，得到的水提取物；
89.(2)对所述的水提取物依次经离心和过滤，得到的滤液进行透析分离，得到黄连蛋白。
90.在本发明的一个优选例中，所述的步骤(1)中，所述的黄连与水的质量比为1:5-20，较佳地1:5-15，更佳地1:8-12，最佳地1:10。
91.在本发明的一个优选例中，所述的步骤(1)中，所述提取的温度为80-100℃，较佳地90-100℃，更佳地100℃。
92.优选地，所述的步骤(1)中，所述的提取是在沸水中进行提取。
93.在本发明的一个优选例中，所述的步骤(2)中，所述离心的温度为10-50℃，较佳地10-40℃，更佳地15-30℃，更佳地20-25℃，最佳地22℃。
94.在本发明的一个优选例中，所述的步骤(2)中，所述离心力为500-1500g，较佳地
800-1200g，更佳地900-1100g，最佳地1000g。
95.在本发明的一个优选例中，所述的步骤(2)中，所述离心的时间为2-8min，较佳地4-6min，更佳地5min。
96.在本发明的一个优选例中，所述的步骤(2)中，所述离心得到的上清液进行所述过滤。
97.在本发明的一个优选例中，所述的步骤(2)中，所述的过滤为微孔滤膜过滤。
98.优选地，所述微孔滤膜的孔径大小为0.1-0.8μm，较佳地0.1-0.5μm，更佳地0.1-0.3μm，更佳地0.18-0.25μm，最佳地0.22μm。
99.在本发明的一个优选例中，所述的步骤(2)中，所述的透析的截留分子量为2500-4500da，较佳地3000-4000da，更佳地3200-3800da，更佳地3400-3600da，最佳地3500da。
100.优选地，所述的步骤(2)中，透析分离后进行冷冻干燥得到所述黄连蛋白。
101.优选地，所述的步骤(2)中，所述黄连蛋白的分子量为20-40da，较佳地25-35da，更佳地22-30da，更佳地26-27da，最佳地28da。
102.载药纳米颗粒及其制备方法
103.本发明提供一种载药纳米颗粒，所述的载药纳米颗粒包括本发明所述的黄连蛋白和药物。
104.优选地，所述黄连蛋白作为纳米颗粒的载体负载药物。
105.优选地，所述的纳米颗粒为纳米粒。
106.优选地，所述的药物包括多西他赛。
107.本发明还提供一种制备本发明所述的载药纳米颗粒的方法，所述的方法包括步骤：
108.(a)将黄连蛋白溶解于水中，得到黄连蛋白水溶液，调节黄连蛋白水溶液的ph，得到黄连蛋白溶液；
109.(b)将药物加入到步骤(a)的所述黄连蛋白溶液中，搅拌得到载药纳米颗粒。
110.具体地，本发明所述的载药纳米颗粒的制备方法如上本发明第四方面所述。
111.用途
112.本发明提供一种黄连蛋白在用于制备递送药物的纳米载体方面中的用途。
113.优选地，所述纳米载体负载药物。
114.优选地，所述纳米载体为纳米颗粒。
115.优选地，所述纳米颗粒为纳米粒。
116.优选地，所述药物包括多西他赛。
117.本发明还提供一种如本发明所述的载药纳米颗粒的用途，用于制备预防和/或治疗疾病的组合物。
118.优选地，所述的疾病为药物的适应症疾病。
119.优选地，所述的药物包括抗癌药物。
120.优选地，所述的药物包括多西他赛。
121.优选地，所述疾病包括肿瘤。
122.本发明还提供一种预防和/或治疗疾病的方法，所述的方法包括步骤：
123.在给所需的对象施用本发明所述的载药纳米颗粒或本发明所述的组合物，从而预
防和/或治疗疾病。
124.优选地，所述的疾病为药物的适应症疾病。
125.优选地，所述的药物包括抗癌药物。
126.优选地，所述的药物包括多西他赛。
127.优选地，所述疾病包括肿瘤。
128.优选地，所述的对象包括人或非人哺乳动物。
129.优选地，所述的非人哺乳动物为小鼠、大鼠、兔、猴、牛、马、羊、狗、猫、猩猩或狒狒。
130.组合物
131.本发明所述的组合物优选为药物组合物，本发明所述的组合物可以包括药学上可接受的载体。
132.如本文所用“药学上可接受的载体”是指一种或多种相容性固体、半固体、液体或凝胶填料，它们适合于人体或动物使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”是指药物或疫苗组合物中的各组分和活性成分以及它们之间相互掺和，而不明显降低药效。
133.应理解，在本发明中，所述的药学上可接受的载体没有特别的限制，可选用本领域常用材料，或用常规方法制得，或从市场购买得到。药学上或疫苗上可接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙甲基纤维素、羧甲基纤维素钠等)、明胶、滑石粉、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油、等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如吐温)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、缓冲剂、螯合剂、增稠剂、ph调节剂、透皮促进剂、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、抑菌剂、无热原水等。
134.在本发明的一个优选例中，所述的组合物或制剂的剂型为固体制剂、液体制剂或半固体制剂。
135.在本发明的一个优选例中，所述的组合物或制剂的剂型为口服制剂、外用制剂或注射制剂
136.代表性地，所述的注射制剂为肌肉注射制剂或皮下注射制剂。
137.药物或疫苗制剂应与给药方式相匹配。本发明药物或疫苗还可与其他协同治疗剂一起使用(包括之前、之中或之后使用)。使用药物或疫苗组合物或制剂时，是将安全有效量的药物或疫苗施用于所需对象(如人或非人哺乳动物)，所述安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
138.本发明的主要优异技术效果包括：
139.(1)本发明开发一种黄连蛋白，所述的黄连蛋白用作递送药物的纳米载体能够显著提高多西他赛的溶解性、溶出速率和口服生物利用度，从而提高多西他赛口服应用价值。
140.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，以下具体实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体操作过程，但本发明的保护范围并不限于本实施例。
141.实施例1
142.1.从黄连中提取得到黄连蛋白
143.①
采用常规方法制备黄连水煎液(黄连(coptis chinensis franch)与水的质量比为1：10，沸水煎煮两次，每次1小时)，将两次煎煮后的滤液合并后在60℃真空干燥得水提物粉末，置于阴凉、干燥处贮存；
144.②
将黄连水提物粉末溶解于纯水中，22℃下以1000g离心5min离心除去未溶解部分，将上清液以0.22μm微孔滤膜过滤除去团块；
145.③
取滤液以透析法(3500da截留分子量)分离获得黄连蛋白，-20℃冻干备用，电泳实验测定黄连蛋白分子量约为28kda。
146.2.多西他赛纳米粒的筛选及其优化
147.2.1温度的单因素考察
148.将黄连蛋白冻干粉溶解于水中，振摇2h，4℃静置12h；将溶液加热(65℃、70℃或75℃)30min，然后冷却至室温(22℃)；室温下以1000g离心5min去除未溶解蛋白；以bca试剂盒测定上清液中蛋白浓度，调整至1mg/ml；以氢氧化钠或盐酸溶液调节溶液ph值为8；将多西他赛乙醇溶液缓慢滴加到溶液中(乙醇终浓度不超过1％)，并控制药物浓度为0.3mg/ml；搅拌12h以自组装形成纳米粒；室温下以10000g离心10min除去团块制得纳米粒溶液；冷冻干燥制得纳米粒冻干粉。
149.精密称取上述冻干粉适量，以纯水配制1mg/ml的纳米粒溶液，以动态光散射技术检测纳米粒粒径、多分散系数pdi及zeta电位。结果(表1)表明，随着温度的升高，65℃和70℃加热后粒径无显著性差异，75℃条件下粒径较大；多分散系数逐渐增大；三个温度处理后均能生成较稳定的载药纳米粒。因此，确定65℃是加热的最佳温度。
150.表1不同温度对纳米粒的影响(mean
±
sd，n＝3)
[0151][0152]
2.2黄连蛋白初始浓度的单因素考察
[0153]
将黄连蛋白冻干粉溶解于水中，振摇2h，4℃静置12h；将溶液加热(65℃)30min，然后冷却至室温(22℃)；室温下以1000g离心5min去除未溶解蛋白；以bca试剂盒测定上清液中蛋白浓度，调整至适当浓度(0.3、0.6、0.8、1、3mg/ml)；以氢氧化钠或盐酸溶液调节溶液ph值为8；将多西他赛乙醇溶液缓慢滴加到溶液中(乙醇终浓度不超过1％)，并控制药物浓度为0.3mg/ml；搅拌12h以自组装形成纳米粒；室温下以10000g离心10min除去团块制得纳米粒溶液；冷冻干燥制得纳米粒冻干粉。
[0154]
精密称取上述冻干粉适量，以纯水配制1mg/ml的纳米粒溶液，以动态光散射技术检测纳米粒粒径、多分散系数pdi及zeta电位。结果(表2)表明，在0.3-1mg/ml范围内，随着蛋白浓度的升高，纳米粒粒径逐渐减小，当浓度过大时，粒径增大；黄连蛋白浓度对纳米粒分散性影响较小；电位绝对值随着浓度增大而减小。因此，确定1mg/ml是黄连蛋白最佳初始浓度。
[0155]
表2不同蛋白浓度对纳米粒的影响(mean
±
sd，n＝3)
[0156][0157]
2.3药载比的单因素考察
[0158]
将黄连蛋白冻干粉溶解于水中，振摇2h，4℃静置12h；将溶液加热(65℃)30min，然后冷却至室温(22℃)；室温下以1000g离心5min去除未溶解蛋白；以bca试剂盒测定上清液中蛋白浓度，调整至适当浓度1mg/ml)；以氢氧化钠或盐酸溶液调节溶液ph值为8；将多西他赛乙醇溶液缓慢滴加到溶液中(乙醇终浓度不超过1％)，并控制药物浓度(0.05、0.1、0.15、0.2、0.3或0.4mg/ml)；搅拌12h以自组装形成纳米粒；室温下以10000g离心10min除去团块制得纳米粒溶液；冷冻干燥制得纳米粒冻干粉。
[0159]
精密称取上述冻干粉适量，以纯水配制1mg/ml的纳米粒溶液，以动态光散射技术检测纳米粒粒径、多分散系数pdi及zeta电位。结果(表3)表明，在0.05-0.4范围内，随着药载比的增加，粒径和电位绝对值都逐渐减小，当药载比为0.2时，粒径为143.8nm，粒径最小；但随着药载比继续增加时，粒径和电位绝对值都逐渐增加。药载比对多分散指数影响无明显趋势。综合考虑尺寸、pdi及zeta电位，确定最佳药载比为0.3。
[0160]
表3不同药载比对纳米粒的影响(mean
±
sd，n＝3)
[0161][0162]
2.4 ph的单因素考察
[0163]
将黄连蛋白冻干粉溶解于水中，振摇2h，4℃静置12h；将溶液加热(65℃)30min，然后冷却至室温(22℃)；室温下以1000g离心5min去除未溶解蛋白；以bca试剂盒测定上清液中蛋白浓度，调整至适当浓度1mg/ml)；以氢氧化钠或盐酸溶液调节溶液至适当ph值(8、9、10)；将多西他赛乙醇溶液缓慢滴加到溶液中(乙醇终浓度不超过1％)，并控制药物浓度为0.3mg/ml)；搅拌12h以自组装形成纳米粒；室温下以10000g离心10min除去团块制得纳米粒溶液；冷冻干燥制得纳米粒冻干粉。
[0164]
精密称取上述冻干粉适量，以纯水配制1mg/ml的纳米粒溶液，以动态光散射技术检测纳米粒粒径、多分散系数pdi及zeta电位。结果(表4)表明，在8-10范围内，当ph越大时，粒径和pdi越小，zeta电位值越小，表明ph＝10时，制备的纳米粒粒径较小，分散性和稳定性较好。因此，确定纳米粒制备环境的最佳ph值为10。
[0165]
表4不同ph对纳米粒的影响(mean
±
sd，n＝3)
[0166][0167]
2.5正交设计实验考察
[0168]
选取对纳米粒制备影响较大的四个因素(温度、ph值、药载比、黄连蛋白初始浓度)进行正交实验，每个因素设计三个水平，如表5所示。运用正交表进行实验，重复三次，结果取平均值。
[0169]
表5正交设计因素及水平表
[0170][0171]
制备方法如下：
[0172]
将黄连蛋白冻干粉溶解于水中，振摇2h，4℃静置12h；将溶液加热(65℃、70℃、75℃)30min，然后冷却至室温(22℃)；室温下以1000g离心5min去除未溶解蛋白；以bca试剂盒测定上清液中蛋白浓度，调整至适当浓度(0.6、0.8、1mg/ml))；以氢氧化钠或盐酸溶液调节溶液至适当ph值(8、9、10)；将多西他赛乙醇溶液缓慢滴加到溶液中(乙醇终浓度不超过1％)，并控制药物浓度(0.2、0.3、0.4mg/ml)；搅拌12h以自组装形成纳米粒；室温下以10000g离心10min除去团块制得纳米粒溶液；冷冻干燥制得纳米粒冻干粉。
[0173]
精密称取上述冻干粉适量，以纯水配制1mg/ml的纳米粒溶液，以动态光散射技术检测纳米粒粒径、多分散系数pdi及zeta电位。结果(表6)表明，粒径的最优条件为a1b3c1d3；pdi的最优条件是a1b1c1d3；zeta电位的最优条件是a2b1c2d3。考虑到粒径是纳米粒最主要的因素之一，结合单因素结果分析，最终确定a1b3c2d3为载药纳米粒最优制备工艺，即加热温度为65℃，蛋白浓度为1mg/ml，药载比为0.3，ph为10。
[0174]
表6温度(a)、蛋白浓度(b)、载药比(c)和ph(d)的四因素三水平正交实验(n＝3)
[0175][0176]
3.多西他赛纳米粒的制备及效果平价
[0177]
3.1多西他赛纳米粒的制备
[0178]
将32.0mg的黄连蛋白冻干粉溶解于6.4ml水中，在22℃下振摇2h后在4℃静置12h。将溶液在65℃加热30min后冷却至22℃，然后以10000g离心10min去除未溶解蛋白。以bca试剂盒测得上清液中蛋白浓度为2.34mg/ml；取6ml该黄连蛋白溶液加水至14.04ml，调整蛋白浓度至1mg/ml。以0.2mm氢氧化钠调节黄连蛋白溶液ph值至10。将0.14ml浓度为30mg/ml的多西他赛乙醇溶液缓慢滴加到13.86ml该黄连蛋白溶液中，使乙醇终浓度不超过1％而多西他赛浓度为0.3mg/ml。在22℃避光搅拌12h以自组装形成纳米粒。在22℃以10000g离心10min除去团块，制得纳米粒溶液，冷冻干燥制得多西他赛纳米粒冻干粉。
[0179]
多西他赛纳米粒效果评价包括以下指标。
[0180]
①
纳米粒粒径及zeta电位
[0181]
精密称取上述多西他赛纳米粒冻干粉适量，以纯水配制1mg/ml的纳米粒溶液，以动态光散射技术检测纳米粒粒径、多分散系数pdi及zeta电位。结果表明，所得多西他赛纳米粒粒径为137.3nm，pdi为0.46，zeta电位为-19.4mv。
[0182]
②
多西他赛载样量和包封率
[0183]
取多西他赛纳米粒混悬液2ml，置于10ml量瓶，加入甲醇定容，称定重量，超声30min，再以甲醇补足缺失的重量。取1ml溶液过0.45μm有机膜，取滤液进行定量分析，测定纳米中多西他赛质量。
[0184]
取多西他赛纳米粒混悬液2ml，置于4.5ml超滤离心管(截留分子量3500da)，以1000g离心20min后，收集下层滤液，甲醇稀释后测定游离多西他赛质量。
[0185]
每组样本数为3。按以下公式计算包封率(ee)与载药量(dl)，其中m
总
是药物总质量，m
游离
是游离的药物质量，m
载体
是纳米中载体的质量：
[0186]
ee＝(m
总-m
游离
)/m
总
*100％
[0187]
dl＝(m
总-m
游离
)/m
载体
*100％
[0188]
结果表明，多西他赛纳米粒中多西他赛包封率可达77.6
±
8.5％，载药量为6.8
±
1.9％。
[0189]
③
对多西他赛饱和溶解度的影响
[0190]
分别取游离多西他赛、及多西他赛纳米粒冻干粉，分别配制其过饱和溶液，37℃、
100rpm振摇24h，静置2h后以20000g离心10min后取上清，以lc-ms/ms测定其中多西他赛浓度，计算饱和溶解度。每组样本数为3。
[0191]
多西他赛lc-ms/ms定量分析方法如下：
[0192]
于离心管中加入样品、内标及样品三倍体积的乙腈，充分旋涡后离心吸取上清液，加入等体积纯水混匀后进样分析。色谱柱为acquityuplcbehc18(1.7μm，2.1
×
100mm)；流动相a相为1mm甲酸铵-水，b相为甲醇；梯度洗脱：0min，60％b；1min，60％b；3.5min，90％b；4.0min，60％b；5.5min，60％b；柱温：40℃，体积流量0.3ml/min，进样量10μl。质谱采用esi离子源；正离子模式下多反应检测模式；测定多西他赛检测离子对为m/z808.4
→
527.4，内标紫杉醇检测离子对为m/z854.2
→
569.2。该方法已验证，适用于多西他赛定量分析。
[0193]
结果(图1)表明，多西他赛纳米粒中多西他赛溶解度相当于游离多西他赛对照组约13.9倍(p《0.01)，表明纳米粒可显著改善多西他赛溶解性。
[0194]
④
对多西他赛在人工胃液、人工肠液中溶出的影响
[0195]
采用透析法测定多西他赛纳米粒中多西他赛在人工胃液、肠液中的溶出情况。透析袋截留分子量为3500da。先将透析袋浸泡于纯中，煮沸10min然后以纯水清洗3次，浸泡备用。精密量取多西他赛纳米粒的分散液(含0.2mg/ml多西他赛)以及作为对照组的游离多西他赛原药溶液(含0.2mg/ml多西他赛)各2.0ml，置于透析袋内。将透析袋置于900ml温度为37℃的人工胃液(取稀盐酸16.4ml，加约800ml水及胃蛋白酶10g，摇匀后加水稀释成1000ml)或人工肠液(取磷酸二氢钾6.8g，加水500ml使溶解，用0.1m氢氧化钠溶液调节ph值至6.8；另取胰酶10g，加水适量溶解，将两液混合后，加水稀释至1000ml)中。设定转速为50rpm。在设定时间点(参照药典规定，人工胃液为5min、15min、30min、45min、1h、1.5h及2h，人工肠液为5min、15min、30min、1h、1.5h、2h、3h、4h、6h)在固定位置吸取溶出介质1ml，然后立即补充等量空白溶出介质。样品以0.22μm滤膜滤过。滤膜在第一次使用时先以5ml滤液饱和。样品在-80℃冰箱保存，适度稀释后以前述lc-ms/ms方法测定样品中多西他赛浓度并计算累积释放百分率。每组样本数为3。
[0196]
如图2所示，多西他赛纳米粒中多西他赛在人工胃液、人工肠液中的溶出度均显著优于游离多西他赛对照组。
[0197]
⑤
对多西他赛在大鼠血浆药动学的影响
[0198]
将10只正常大鼠按体重(220-240g)随机分为2组，即每组5只大鼠。分别灌予(1ml/100g体重)大鼠游离多西他赛(20mg/kg)及多西他纳米粒(其中，多西他赛剂量相当于20mg/kg)水溶液。于给药后设定时间点(0.125、0.25、0.5、1、2、3、4、6、8、12h)，分别从眼眶后静脉丛取血液(约0.2ml)制备血浆。采用蛋白沉淀法处理后，以前述lc-ms/ms检测各血浆样本中多西他赛浓度，确定对多西他赛在大鼠血浆药动学的影响。
[0199]
如图3及表7所示，与对照组相比，灌胃纳米粒组中多西他赛血药动力学显著改善，主要表现为达峰时间(t
max
)提前，并且药动学参数c
max
及auc
0-12h
显著升高。
[0200]
表7灌胃给药后纳米粒中多西他赛(nnps-dtx)与游离多西他赛(dtx)在大鼠体循环中药动学参数(mean
±
sd，n＝5).
[0201][0202]
*,p《0.05,**,p《0.01vs dtx；
[0203]
t
max
为达到最大血药浓度的时间；
[0204]
t
1/2
为半衰期；
[0205]cmax
为最大血药浓度
[0206]
auc
0-12h
为0-12h的血药浓度曲线下的面积；
[0207]
mrt
0-12h
为平均滞留时间。
[0208]
以上所述是本发明针对一种案例设计的实施方案，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下还可以作出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。