基于基因芯片的检测方法、杂交反应体系及试剂盒与流程

本技术涉及生物，主要涉及一种基于基因芯片的检测方法、杂交反应体系及试剂盒。

背景技术：

1、液相芯片技术通过两种或两种以上不同的荧光染料对微球进行染色，实现微球荧光信息的多重编码，从而在单管反应中实现对多种指标的同时检测。同时该技术具有检测通量高、消耗样品少、反应时间短、灵敏度高及重复性好等特点，在多重蛋白分子检测及核酸（基因）检测等领域有广泛的应用。

2、液相基因芯片技术的基本原理是基于核酸分子杂交，先将核酸捕获探针修饰在微球表面，然后与带荧光标记的样品进行杂交，最后通过流式细胞仪或液相芯片分析仪对微球表面的荧光信号进行分析，进而获知样品中是否存在目标核酸。该技术在基因分型、snp检测及病原体检测等领域均有广泛应用。目前，液相基因芯片技术多采用pcr技术对待检测的目标基因片段进行体外扩增，生成大量荧光标记或生物素标记的单链或双链dna产物，再通过与微球上的特异性核酸捕获探针经过升温变性-降温复性过程形成微球-探针-产物复合物，最终通过监测微球上的捕获探针捕获到的产物荧光强弱来分析待检样品的阳性或阴性。因此，探针-产物的杂交效率对液相基因芯片的检测灵敏度至关重要。

3、影响核酸捕获探针与扩增产物杂交效率的因素包括：杂交反应的退火温度、杂交缓冲液类型（离子浓度、离子种类、ph等）、核酸捕获探针及扩增产物核酸序列的二级结构等，除此之外，普通pcr扩增产物多为双链，产物正义链-反义链之间的退火复性与探针-产物之间的杂交相互竞争，也会导致杂交效率降低。尽管通过不对称pcr富集单链产物可以降低杂交时产物双链复性带来的影响，但是不对称pcr始终会产生部分双链产物或产生的单链若存在折叠的二级结构同样会限制杂交效率的进一步提高。同时，核酸捕获探针与带有荧光标记的引物/引物二聚体的非特异性结合会导致背景信号增加，信噪比下降，同样会导致液相基因芯片检测灵敏度下降。

4、因此，现有技术还有待于改进和发展。

技术实现思路

1、鉴于上述现有技术的不足，本技术的目的在于提供一种基于基因芯片的检测方法、杂交反应体系及试剂盒，旨在解决现有液相基因芯片检测灵敏度有待提高的问题。

2、本技术的技术方案如下：

3、一种基于基因芯片的检测方法，其中，包括以下步骤：

4、（1）通过pcr扩增对待测样品进行扩增，待测样品中含有或不含有目标基因片段；

5、（2）将扩增产物与带有核酸捕获探针的基因芯片进行杂交：在杂交反应体系中加入辅助杂交序列，所述核酸捕获探针与所述扩增产物中的靶序列结合，所述辅助杂交序列与所述扩增产物中除所述靶序列以外的其他序列结合；

6、（3）对杂交产物进行检测分析，判断所述待测样品中是否含有所述目标基因片段。

7、在本技术中，通过特异性设计的辅助杂交序列降低双链产物退火和二级结构的影响，以此在降低基因芯片杂交背景信号的同时可以提高基因芯片表面核酸捕获探针杂交效率和信噪比，进而提升基因芯片的检测灵敏度。所述的基于基因芯片的检测方法，其中，所述辅助杂交序列为所述pcr扩增时所采用的引物。

8、若使用引物作为辅助杂交序列，从一定程度上能降低核酸捕获探针与带标记的引物的结合效率，从而降低检测的背景信号。

9、所述的基于基因芯片的检测方法，其中，每一所述目标基因片段对应设置一种或两种以上的所述辅助杂交序列。

10、一种基于基因芯片的杂交反应体系，其中，包括扩增产物、基因芯片、至少一种辅助杂交序列；

11、所述扩增产物是对待测样品进行pcr扩增得到的；

12、所述基因芯片上带有至少一种核酸捕获探针；

13、所述辅助杂交序列用于与所述扩增产物的dna双链上除所述核酸捕获探针要结合的靶序列以外的其他区域序列结合。

14、所述的基于基因芯片的杂交反应体系，其中，所述辅助杂交序列为所述pcr扩增时所用的引物。

15、所述的基于基因芯片的杂交反应体系，其中，还包括杂交缓冲液、鲑鱼精和te缓冲液；

16、所述杂交缓冲液为2×杂交缓冲液，基础组分为2.5 m 四甲基氯化铵、100 mmtris-hcl、2.5 mm edta及0.1%sds；

17、所述杂交缓冲液在所述杂交反应体系中的终浓度为1×；

18、所述鲑鱼精在所述杂交反应体系中的终浓度为0.2 mg/ml；

19、每种所述辅助杂交序列在所述杂交反应体系中的终浓度为50 nm~500 nm。

20、一种用于检测新型冠状病毒的试剂盒，其中，所述试剂盒包括基因芯片、引物、辅助杂交序列；

21、所述引物包括以下一种或两种以上：

22、用于新型冠状病毒orf1ab基因的上游引物，其核苷酸序列为如seq id no:1所示；

23、用于新型冠状病毒orf1ab基因的下游引物，其核苷酸序列如seq id no:2所示；

24、用于新型冠状病毒n基因的上游引物，其核苷酸序列如seq id no:6所示；

25、用于新型冠状病毒n基因的下游引物，其核苷酸序列如seq id no:7所示；

26、所述基因芯片上连接有以下核酸捕获探针中的一种或两种：

27、用于新型冠状病毒orf1ab基因的核酸捕获探针，其核苷酸序列如seq id no:3所示；

28、用于新型冠状病毒n基因的核酸捕获探针，其核苷酸序列如seq id no:8所示；

29、所述辅助杂交序列的核苷酸序列与所述引物的核苷酸序列相同。

30、一种用于检测鼻病毒的试剂盒，其中，所述试剂盒包括基因芯片、引物、辅助杂交序列；

31、所述引物包括以下一种或两种：

32、用于鼻病毒5’utr基因的上游引物，其核苷酸序列如seq id no:15所示；

33、用于鼻病毒5’utr基因的下游引物，其核苷酸序列如seq id no: 16所示；

34、所述基因芯片上连接有用于捕获鼻病毒5’utr基因的核酸捕获探针，其核苷酸序列如seq id no: 17所示；

35、所述辅助杂交序列的核苷酸序列与所述引物的核苷酸序列相同。

36、一种用于检测博卡病毒的试剂盒，其中，所述试剂盒包括基因芯片、引物、辅助杂交序列；

37、所述引物包括以下一种或两种：

38、用于博卡病毒np1基因的上游引物，其核苷酸序列如seq id no:20所示；

39、用于博卡病毒np1基因的下游引物，其核苷酸序列如seq id no: 21所示；

40、所述基因芯片上连接有用于捕获博卡病毒np1基因的核酸捕获探针，其核苷酸序列如seq id no: 22所示；

41、所述辅助杂交序列的核苷酸序列与所述引物的核苷酸序列相同。

42、一种用于检测偏肺病毒的试剂盒，其中，所述试剂盒包括基因芯片、引物、辅助杂交序列；

43、所述引物包括以下一种或两种：

44、用于偏肺病毒n基因的上游引物，其核苷酸序列如seq id no:25所示；

45、用于偏肺病毒n基因的下游引物，其核苷酸序列如seq id no: 26所示；

46、所述基因芯片上连接有用于捕获偏肺病毒n基因的核酸捕获探针，其核苷酸序列如seq id no: 27所示；

47、所述辅助杂交序列的核苷酸序列与所述引物的核苷酸序列相同。

48、有益效果：本技术所提供的基于基因芯片的检测方法，通过在杂交反应体系中添加辅助杂交序列，能有效提高基因芯片表面的核酸捕获探针杂交的效率，同时减少核酸捕获探针非特异结合导致的背景信号增加，从而能有效提高杂交信号的信噪比。