一种对SARS-CoV-2变异株具有高亲和力的抗体的制作方法

本发明属于抗体工程领域，具体涉及一种针对冠状病毒的治疗性单抗，特别是涉及一种对抗sars-cov-2单抗进行突变、以提高对变异毒株亲和力的方法及获得的抗sars-cov-2单抗突变株。

背景技术：

1、目前对于新型冠状病毒所致疾病没有特异治疗方法，需根据患者临床情况进行治疗。《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第五版)》公布，在重型、危重型病人治疗的其他治疗措施中，可采用恢复期血浆治疗。康复者血浆主要用于病情进展较快、重症、危重症新冠肺炎患者。原则上病程不超过3周；新冠病毒核酸检测阳性或临床专家判定患者存在病毒血症，在病情急性进展期应当尽早使用。尽管康复患者血浆疗法在临床上取得了一定的成效，然而由于抗原患者血浆来源有限、纯化抗体安全隐患高、特异性抗体效价不稳定。效价高、性能稳定、安全性好的单克隆抗体对于控制新冠状病毒疫情具有良好的应用前景。

2、目前现有文献已经公开或教导了针对新冠病毒rbd制备保护性中和单抗的报道。利用新冠病毒刺突蛋白rbd产生抗新冠病毒的保护性中和抗体已开始陆续进入临床。

3、尽管抗sars-cov-2中和性抗体药物的研究取得了很大的进展，但 sars-cov-2的变异速度快，《病毒学报》2月8日发布的一项新的研究显示，新型冠状病毒自流行至今，已演变出800余个不同亚型或分支。 sars-cov-2的不断变异导致中和性抗体的预防和治疗效果具有不稳定性，特别是sars-cov-2s蛋白关键位点的突变，容易导致目前针对s蛋白的中和性抗体对sars-cov-2的中和活性降低甚至丧失。

4、由此，对于变异速度快速的sars-cov-2具有良好治疗效果的中和性抗体药物有待研究。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本公开提供一种提高抗sars-cov-2抗体对sars-cov-2 突变株结合能力的方法，包括：(1)对抗sars-cov-2抗体与抗原晶体复合物结构进行解析，确定抗原上与抗sars-cov-2抗体作用的位点、以及抗 sars-cov-2抗体上与抗原作用的位点；(2)根据已有的sars-cov-2的自然突变位点，选择在抗原上的作用位点不易产生自然突变的抗sars-cov-2抗体作为出发抗体；(3)对可能与sars-cov-2的自然突变位点相互作用的抗sars-cov-2抗体上的位点进行突变；(4)选择与出发抗体相比，对sars-cov-2 突变株结和力提高的突变抗体。本公开所述方法能够从根据最初的sars-cov-2 野生株制备的抗sars-cov-2抗体中，通过选择、突变快速获得对sars-cov-2 突变株具有高亲和力、高中和活性的新抗体。具体而言：

2、一方面，本发明提供一种提高抗sars-cov-2抗体或其片段对sars-cov-2 突变株结合能力的方法，包括：

3、(1)将候选抗sars-cov-2抗体或其片段与抗原的晶体复合物结合得到抗原抗体晶体复合物，并对所述抗原抗体晶体复合物进行结构解析，确定所述抗原上与所述候选抗sars-cov-2抗体或其片段作用的位点、以及所述候选抗 sars-cov-2抗体或其片段上与所述抗原作用的位点；

4、(2)根据已有的sars-cov-2的自然突变位点，选择在抗原上的作用位点不易产生自然突变的候选抗sars-cov-2抗体或其片段作为出发抗体或其片段；

5、(3)对可能与sars-cov-2的自然突变位点相互作用的出发抗体或其片段上的位点进行突变，以便得到突变后抗体或其片段；

6、(4)筛选与出发抗体或其片段相比，对sars-cov-2突变株结和力提高的突变后抗体或其片段。

7、根据本发明的实施例，所述候选抗sars-cov-2抗体或其片段是根据 sars-cov-2野生株抗原制备的抗sars-cov-2抗体或其片段。其中，需要说明的是，该sars-cov-2野生株是早期已有的sars-cov-2野生株抗原。

8、根据本发明的实施例，所述候选抗sars-cov-2抗体或其片段为结合 sars-cov-2s1蛋白rbd区的中和性抗体或其片段，优选地，所述中和性抗体或其片段为人源化抗体或其片段、人抗体或其片段。

9、根据本发明的实施例，出发抗体或其片段具有seq id no:1所示的轻链可变区氨基酸序列，和/或seq id no:2所示重链可变区氨基酸序列。

10、根据本发明的实施例，所述的抗原来自sars-cov-2的s1蛋白rbd区，抗原上与所述出发抗体或其片段作用的位点、以及所述出发抗体或其片段上与抗原作用的位点选自下列组中至少之一：

11、(1)所述抗原的y369与所述出发抗体的重链y102和g106之间具有范德华力作用，与所述出发抗体的重链y107之间具有范德华力和氢键作用；

12、(2)所述抗原的a372与所述出发抗体的重链r110以及轻链的y32和s93 之间具有范德华力作用，与所述出发抗体的轻链n92之间具有范德华力和氢键作用；

13、(3)所述抗原的s373与所述出发抗体的重链r110和轻链的y32之间具有范德华力作用；

14、(4)所述抗原的f374与所述出发抗体的重链y107之间具有范德华力作用，与所述出发抗体的重链r110和轻链y32之间具有范德华力和氢键作用；

15、(5)所述抗原的s375与所述出发抗体的重链y107、y108、f109和e111 以及轻链的y32之间具有范德华力作用，与所述出发抗体的重链r110之间具有范德华力和氢键作用；

16、(6)所述抗原的t376与所述出发抗体的重链y107之间具有范德华力作用，与所述出发抗体的重链y108之间具有范德华力和氢键作用；

17、(7)所述抗原的f377与所述出发抗体的重链g106之间具有范德华力作用，与所述出发抗体的重链y107之间具有范德华力和氢键作用；

18、(8)所述抗原的k378与所述出发抗体的重链y101、d103、s105、g106 和y107之间具有范德华力作用；

19、(9)所述抗原的c379与所述出发抗体的重链s105之间具有范德华力和氢键作用；

20、(10)所述抗原的v382与所述出发抗体的重链s105之间具有范德华力作用；

21、(11)所述抗原的s383与所述出发抗体的重链s104之间具有范德华力作用；

22、(12)所述抗原的p384与所述出发抗体的重链s105之间具有范德华力作用；

23、(13)所述抗原的t385与所述出发抗体的重链s104之间具有范德华力作用；

24、(14)所述抗原的g404与所述出发抗体的重链y108之间具有范德华力作用；

25、(15)所述抗原的d405与所述出发抗体的重链y108之间具有范德华力作用；

26、(16)所述抗原的v407与所述出发抗体的重链y108之间具有范德华力作用；

27、(17)所述抗原的r408与所述出发抗体的重链y108之间具有范德华力和氢键作用；

28、(18)所述抗原的n437与所述出发抗体的重链e111和轻链n31之间具有范德华力作用；

29、(19)所述抗原晶的n439与所述出发抗体的轻链s52之间具有范德华力作用；

30、(20)所述抗原的n440与所述出发抗体的轻链s67之间具有范德华力作用；

31、(21)所述抗原的p499与所述出发抗体的轻链s52之间具有范德华力作用；

32、(22)所述抗原的n501与所述出发抗体的轻链s52之间具有范德华力作用；

33、(23)所述抗原的g502与所述出发抗体的轻链s53之间具有范德华力作用；

34、(24)所述抗原的v503与所述出发抗体的重链f109以及轻链y49和a50 之间具有范德华力作用，与所述出发抗体的轻链s53之间具有范德华力和氢键作用；

35、(25)所述抗原的q506与所述出发抗体的轻链s52之间具有范德华力作用；

36、(26)所述抗原的y508与所述出发抗体的重链f109之间具有范德华力作用，与所述出发抗体的重链e111之间具有范德华力和氢键作用

37、根据本发明的实施例，所述sars-cov-2突变株具有选自s1蛋白rbd区中以下位点中的一个或多个位点的突变：

38、446g、501n、455l、417k、475a、505y、493q、453y、486f、446g、 501n、417k、456f、477s、439n、520a、344a、382v、367v、330p、479p、 483v、494s、518l、444k、477s、341v、384p、354n、478t、408r、459s、 483v、476g、484e、385t、348a、506q、334n、370n、373s、403r、411a、481n、508y、414q，

39、其中，所述突变包括缺失、取代、插入。

40、根据本发明的实施例，所述sars-cov-2突变株具有选自s蛋白rbd区中以下位点中的一个或多个突变：

41、446g>v、501n>y、455l>f、417k>n、475a>v、505y>c、493q>l、453y>f、 486f>l、446g>s、501n>t、417k>r、456f>l、477s>n/i/t、439n>k、520a>s、 344a>t/s、382v>l、367v>f/l、330p>s/a、479p>s、483v>a、494s>p/a、 518l>i、444k>n、477s>r、341v>i、384p>l、354n>k、478t>k/i/r、408r>k/i/t、 459s>y/f、483v>i/f、476g>s000、484e>k/q、385t>n/i、348a>t/s、506q>k/*、 334n>k、370n>s、373s>l、403r>k、411a>s、481n>d、508y>h、414q>k/*/x。

42、第二方面，本发明提供一种结合sars-cov-2突变株的抗体或其片段。根据本发明的实施例，通过本发明前述任一项所述提高抗sars-cov-2抗体或其片段对sars-cov-2突变株结合能力的方法制备。

43、根据本发明的实施例，对sars-cov-2突变株具有高亲和力、和/或高中和活性。

44、第三方面，本发明提供一种结合sars-cov-2突变株的抗体或其片段，根据本发明的实施例，该抗体或其片段的轻链可变区和重链可变区的cdr区的氨基酸序列如下：

45、lcdr1：rasqgix1nyla，

46、lcdr2：aax2slqs，

47、lcdr3：lqhnsypy，

48、hcdr1：syamn，

49、hcdr2：visgsgx3x4tyyadsvrg，

50、hcdr3：gyx5ydssgyyfredafdi；

51、其中，

52、x1选自s、q、k，

53、x2选自s、n、q，

54、x3选自g、y，

55、x4选自s、y、f，

56、x5选自y、e。

57、根据本发明的实施例，所述抗体或其片段不是具有seq id no:1所示的轻链可变区，和seq id no:2所示重链可变区的抗体或其片段。

58、根据本发明的实施例，所述抗体或其片段的轻链可变区不具有seq id no:1所示的序列，且重链可变区不具有seq id no:2所示的序列。

59、根据本发明的实施例，所述抗体或其片段对sars-cov-2突变株的结合能力/中和能力，高于对早期sars-cov-2野生株的结合能力/中和能力、或与对 sars-cov-2野生株的结合能力/中和能力相当。

60、根据本发明的实施例，所述sars-cov-2突变株具有选自s1蛋白rbd区中以下位点或位点组合的突变：n501、k417/e484/n501、n439、l452、 e484/l452。

61、根据本发明的实施例，所述sars-cov-2突变株具有选自s1蛋白rbd区中以下位点或位点组合的突变：n501y、k417n/e484k/n501y、 k417t/e484k/n501y、n439r、l452r、e484q/l452r。

62、第四方面，本发明提供一种组合物。根据本发明的实施例，该组合物包含一种或多种选自前述任一项所述结合sars-cov-2突变株的抗体或其片段。

63、第五方面，本发明提供一种多核苷酸，其编码前述任一项所述结合sars-cov-2突变株的抗体或其片段。

64、第六方面，本发明提供一种核酸构建体，其包含前述多核苷酸。

65、第七方面，本发明提供一种宿主细胞，其包含前述多核苷酸或前述核酸构建体。

66、第八方面，本发明提供前述任一项所述结合sars-cov-2突变株的抗体或其片段、前述组合物、前述多核苷酸、前述核酸构建体、前述宿主细胞在制备治疗sars-cov-2感染或新冠肺炎药物中的用途。

67、进一步，根据本发明的实施例，所述sars-cov-2感染或新冠肺炎是由 sars-cov-2野生株、和/或sars-cov-2突变株引起。

68、为更好理解本发明，首先定义一些术语。其他定义则贯穿具体实施方式部分而列出。

69、术语“冠状病毒”是指套式病毒目(nidovirales)、冠状病毒科 (coronaviridae)、冠状病毒属(coronavirus)的成员。本发明所述冠状病毒主要涉及感染人的冠状病毒，包括hcov-229e、hcov-oc43、hcov-nl63、 hcov-hku1、sars-cov、mers-cov、sars-cov-2(2019-ncov)，本发明所述冠状病毒特别涉及sars-cov、mers-cov、sars-cov-2(2019-ncov)。

70、术语“特异性”是指在蛋白和/或其他生物异质群体中确定是否存在所述蛋白，例如本发明所述单抗与sars-cov-2rbd蛋白的结合反应。因此，在所指定的条件下，特定的配体/抗原与特定的受体/抗体结合，并且并不以显著的量与样本中存在的其它蛋白结合。

71、本文中的术语“抗体”意在包括全长抗体及其任何抗原结合片段(即，抗原结合部分)或单链。全长抗体是包含至少两条重(h)链和两条轻(l)链的糖蛋白，重链和轻链由二硫键连接。各重链由重链可变区(简称vh)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域构成，即ch1、ch2和ch3。各轻链由轻链可变区(简称vl)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域cl构成。vh和vl区还可以划分为称作互补决定区(cdr)的高变区，其由较为保守的框架区(fr)区分隔开。各vh和vl由三个cdr以及四个fr构成，从氨基端到羧基端以fr1、 cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4的顺序排布。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括多种免疫系统细胞(例如，效应细胞)和传统补体系统的第一组分(c1q)。

72、术语“单克隆抗体”或“单抗”是指单一分子组成的抗体分子制品。单克隆抗体组成呈现出对于特定表位的单一结合特异性和亲和力。

73、本文中的术语，抗体的“抗原结合片段”(或简称为抗体部分)，是指抗体的保持有特异结合抗原能力的一个或多个片段。已证实，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来实施。包含在抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的例子包括(i)fab片段，由vl、vh、cl和ch1构成的单价片段；(ii)f(ab′)2片段，包含铰链区二硫桥连接的两个fab片段的二价片段；(iii)由vh和ch1构成的 fd片段；(iv)由抗体单臂vl和vh构成的fv片段；(v)由vh构成的dab片段 (ward et al.，(1989)nature 341：544-546)；(vi)分离的互补决定区(cdr)；以及(vii) 纳米抗体，一种包含单可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。此外，尽管fv片段的两个结构域vl和vh由不同的基因编码，它们可以通过重组法经由使两者成为单蛋白链的合成接头而连接，其中vl和vh区配对形成单价分子(称为单链fc(scfv)；参见例如bird et al.，(1988)science 242：423-426；and huston et al.，(1988)proc.natl.acad.sci.usa 85：5879-5883)。这些单链抗体也意在包括在术语涵义中。这些抗体片段可以通过本领域技术人员已知的常用技术而得到，且片段可以通过与完整抗体相同的方式进行功能筛选。

74、本发明的抗原结合片段包括能够特异性结合冠状病毒rbd的那些。抗体结合片段的实例包括例如但不限于fab、fab'、f(ab')2、fv片段、单链fv(scfv) 片段和单结构域片段。

75、fab片段含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(ch1)。fab'片段与fab片段的不同之处在于在重链ch1结构域的羧基末端处的少数残基的添加，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。通过切割在f(ab')2胃蛋白酶消化产物的铰链半胱氨酸处的二硫键产生fab'片段。抗体片段的另外化学偶联是本领域普通技术人员已知的。fab和f(ab')2片段缺乏完整抗体的片段可结晶(fc)区，从动物的循环中更快速地清除，并且可能具有比完整抗体更少的非特异性组织结合(参见例如，wahl等人，1983，j.nucl.med.24:316)。

76、如本领域通常理解的，“fc”区是不包含抗原特异性结合区的抗体的片段可结晶恒定区。在igg、iga和igd抗体同种型中，fc区由两个相同的蛋白质片段组成，衍生自抗体的两条重链的第二和第三恒定结构域(分别为ch2和 ch3结构域)。igm和ige fc区在每条多肽链中含有三个重链恒定结构域(ch2、 ch3和ch4结构域)。

77、“fv”片段是含有完整靶识别和结合位点的抗体的最小片段。该区域由以紧密的非共价结合的一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体(vh-vl二聚体)组成。在该构型中，每个可变结构域的三个cdr相互作用，以限定在vh-vl 二聚体的表面上的靶结合位点。通常，六个cdr对抗体赋予靶结合特异性。然而，在一些情况下，甚至单个可变结构域(或仅包含对于靶特异性的三个cdr 的fv的一半)可以具有识别且结合靶的能力，尽管其亲和力低于整个结合位点。

78、“单链fv”或“scfv”抗体结合片段包含抗体的vh和vl结构域，其中这些结构域存在于单条多肽链中。一般地，fv多肽进一步包含在vh和vl结构域之间的多肽接头，其致使scfv能够形成有利于靶结合的结构。

79、“单结构域片段”由对冠状病毒rbd显示出足够亲和力的单个vh或vl 结构域组成。在一个具体实施方案中，单结构域片段是骆驼化的(参见例如， riechmann，1999，journalofimmunological methods 231:25–38)。

80、本发明的抗冠状病毒rbd的抗体包括衍生化抗体。例如，衍生化抗体通常通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/封闭基团的衍生化、蛋白酶解切割、与细胞配体或其它蛋白质的连接来修饰。可以通过已知技术进行众多化学修饰中的任一种，所述技术包括但不限于特定的化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。另外，衍生物可以含有一种或多种非天然氨基酸，例如，使用ambrx技术(参见例如，wolfson，2006，chem.biol. 13(10):1011-2)。

81、“人源抗体”包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，并且包括从人免疫球蛋白文库或动物中分离的抗体，所述动物对于一种或多种人免疫球蛋白是转基因的，并且不表达内源免疫球蛋白。人抗体可以通过本领域已知的各种方法制备，所述方法包括使用衍生自人免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展示方法。参见美国专利号4,444,887和4,716,111；以及pct公开wo 98/46645； wo 98/50433；wo 98/24893；wo 98/16654；wo 96/34096；wo96/33735；和 wo 91/10741。还可以使用不能表达功能性内源免疫球蛋白，但可以表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠来产生人抗体。参见例如，pct公开wo 98/24893； wo92/01047；wo 96/34096；wo 96/33735；美国专利号5,413,923；5,625,126； 5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；5,885,793；5,916,771；和5,939,598。另外，使用与上述类似的技术，公司例如lakepharma，inc. (belmont，ca)或creative biolabs(shirley，ny)可以从事于提供针对所选抗原的人抗体。可以使用被称为“引导选择”的技术生成识别所选表位的全人抗体。在该方法中，选择的非人单克隆抗体，例如小鼠抗体，用于引导识别相同表位的完全人抗体的选择(参见，jespers等人，1988，biotechnology 12:899-903)。

82、术语“识别抗原的抗体”以及“对抗原特异的抗体”在本文中与术语“特异结合抗原的抗体”交替使用。

83、术语“高亲和性”对于igg抗体而言，是指对于抗原的kd为1.0x10-6m以下，优选5.0x10-8m以下，更优选1.0x10-8m以下、5.0x10-9m以下，更优选1.0x10-9m 以下。对于其他抗体亚型，“高亲和性”结合可能会变化。例如，igm亚型的“高亲和性”结合是指kd为10-6m以下，优选10-7m以下，更优选10-8m以下。

84、术语“kassoc”或“ka”是指特定抗体-抗原相互作用的结合速率，而术语“kdis”或“kd”是指特定抗体-抗原相互作用的离解速率。术语“kd”是指解离常数，由kd与ka比(kd/ka)得到，并以摩尔浓度(m)表示。抗体的kd值可以通过领域内已知的方法确定。优选的确定抗体kd的方式是使用表面等离子共振仪(spr)测得的，优选使用生物传感系统例如biacoretm系统测得。

85、术语“ec50”，又叫半最大效应浓度，是指引起50％最大效应的抗体浓度。

86、与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下优点：

87、第一、针对新冠病毒sars-cov-2不断出现新的流行突变株的情况，提供了一种快速获得对sars-cov-2突变株具有高亲和力、高中和活性抗体的方法，克服了sars-cov-2变异速度快、中和性抗体药物研发速度慢的缺陷，从而能够以现有技术已经开发较为成熟的抗体药物为出发点，获得对流行变异株具有高亲和力的抗体药物。

88、第二，尽管不希望受到理论的约束，新冠病毒sars-cov-2产生变异的重要原因之一在于病毒受到宿主的免疫洗脱和治疗性药物的压力。根据 sars-cov-2入侵宿主的机制，现有技术中抗sars-cov-2治疗性抗体主要是基于sars-cov-2的s1蛋白rbd区的宿主受体结合区，以获得尽可能高的中和活性。本发明根据上述原理，选择同时结合于s1rbd中结构相对保守的非 ace2结合区和部分ace2结合区的抗体作为出发抗体，从而避免了 sars-cov-2受体结合区个别氨基酸位点的变化导致的中和活性丧失。

89、第三，本发明通过抗原-抗体复合物晶体结构解析，在分析sars-cov-2的 rbd抗原与其抗体相互作用位点的基础上，根据现有报道的流行突变株在rbd 区的变异情况，通过分子生物学分析设计获得了抗sars-cov-2抗体的突变方案，结果表明根据本发明所述方法制备的突变抗体对抗原的结合能力得到提高，从而能够有效中和/封闭b1.1.7、b1.135等多种流行突变株。