一种抑制PRKACA基因表达的siRNA及其应用的制作方法

一种抑制prkaca基因表达的sirna及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药领域，特别是涉及一种抑制prkaca基因表达的sirna及其应用。


背景技术：

2.胶质瘤是最恶性的肿瘤类型，通常被认为是中枢神经系统癌症中的一种致命疾病。据估计，它占所有恶性脑瘤的75％。由于胶质瘤复发频繁、高度弥漫侵袭、破坏正常脑组织以及对传统和靶向治疗的抵抗，胶质瘤的治疗仍然是癌症治疗中最大的挑战之一。虽然采取了多学科的治疗，但脑胶质瘤患者的预后仍然很差，总的生存期只有14-52个月。
3.替莫唑胺(tmz)是一线化疗药物，可显著改善胶质瘤术后患者的预后。然而，在一些患者中，对tmz的耐药性导致了较差的临床结果。prkaca(蛋白激酶camp激活的催化亚单位α)是细胞内分子磷酸化所必需的，以调节各种分子活性。尽管prkaca参与多种生物学过程，但prkaca的临床预后价值或与prkaca相关的药物敏感性机制的报道很少，而且在某种程度上被低估了。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种抑制prkaca基因表达的sirna及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，该sirna通过抑制prkaca基因表达，增强tmz药物敏感性以及脑胶质瘤治疗效果。
5.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
6.本发明提供一种抑制prkaca基因表达的sirna，所述sirna的核苷酸序列为：5
’‑
gggugaugcuggugaaaca-3’。
7.本发明还提供所述的sirna在制备治疗胶质瘤药物中的应用。优选的是，所述治疗胶质瘤药物为替莫唑胺。
8.本发明还提供所述的sirna在提高治疗胶质瘤药物敏感性中的应用。优选的是，所述治疗胶质瘤药物为替莫唑胺。
9.本发明还提供prkaca基因在制备治疗胶质瘤药物中的应用，抑制所述prkaca基因的表达，以减缓所述胶质瘤细胞的生长、增殖以及dna合成。优选的是，所述治疗胶质瘤药物为替莫唑胺。
10.本发明还提供prkaca基因在提高治疗胶质瘤药物敏感性中的应用，抑制所述prkaca基因的表达，以提高所述治疗胶质瘤药物的敏感性。优选的是，所述治疗胶质瘤药物为替莫唑胺。
11.优选的是，利用sirna敲除所述prkaca基因，以抑制所述prkaca基因的表达；其中，所述sirna的核苷酸序列为：5
’‑
gggugaugcuggugaaaca-3’。
12.本发明还提供一种降低胶质瘤对替莫唑胺耐药性的药物组合物，包括sirna和替莫唑胺。
13.本发明公开了以下技术效果：
14.本发明根据prkaca基因设计一种sirna，该sirna能够敲除prkaca基因，有效降低prkaca基因的表达，进而减缓了胶质瘤细胞的生长、迁移和dna合成。此外，该sirna通过以剂量依赖的方式启动细胞焦亡，并且有效地增强tmz的敏感性，提高tmz治疗胶质瘤的效果。
附图说明
15.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
16.图1为转染siprkaca后对u87-mg细胞中prkaca mrna表达水平(a)和蛋白表达水平(b)的影响；
17.图2为cck-8实验检测转染siprkaca后对u87-mg细胞活性的影响；
18.图3为检测转染siprkaca后对u87-mg细胞迁移的影响；
19.图4为检测转染siprkaca后对u87-mg细胞克隆的影响；
20.图5为检测不同浓度tmz联合siprkaca对细胞活性影响；
21.图6为检测不同浓度tmz联合siprkaca对细胞克隆的影响。
具体实施方式
22.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
23.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
24.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
25.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本技术说明书和实施例仅是示例性的。
26.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
27.实施例1合成全新的源于人prkaca的sirna
28.通过ncbi获得prkaca的基因序列(gene id：5566)，利用软件/网站理性化设计siprkaca，并由生物合成公司合成siprkaca的基因序列。
29.siprkaca的序列如下(seq id no：1)：5
’‑
gggugaugcuggugaaaca-3’。
30.实施例2siprkaca在脑胶质瘤中的应用
31.1、细胞培养与转染
32.1.1细胞培养
33.人脑胶质瘤细胞系u87-mg购自中国典型菌种保藏中心，在含10％胎牛血清(fbs、gibco)的dmem培养液中，37℃、5％co2条件下的加湿培养箱中培养，对数生长期的细胞被胰酶消化、传代或用于后续实验。
34.1.2细胞转染
35.用脂质体2000(invitgen)将针对prkaca的小干扰rna(sirnas、ribobio)导入对数生长期的细胞，转染步骤如下：按照2000转染试剂盒说明书进行转染，2μg sirna/100μl optimem i比例稀释sirna，将2μg sirna加入到装有100μl optimemi的ep管中。枪头上下轻柔吹打3次，室温静置5分钟。从培养箱取出细胞，做好相关标记，将静置的x-treme gene sirna转染试剂-sirna复合物均匀滴入待转染细胞孔。轻轻摇动培养皿，使转染复合物与细胞充分接触。将培养板放于37℃、体积分数为5％的co2饱和湿度培养箱中培养。用定量逆转录聚合酶链式反应(rt-qpcr，vazyme)和免疫印迹法(biorad)验证转染率。
36.1.2.1rt-qpcr验证siprkaca转染效率
37.用trizol试剂(invitgen)从u87-mg细胞中提取总rna，用promega m-mlv试剂盒转录成cdna。rt-qpcr使用takara sybr master mix和mx3000p系统(agilent)进行。用2-δδct
法计算相对表达，并归一化为gapdh mrna的表达。
38.prkaca扩增引物为：
39.正向序列(seq id no：2)：5
‘‑
gcccatccagatctatgagaag-3’；
40.反向序列(seq id no：3)：5
‘‑
tcgttgaccccattcttgag-3’。
41.gapdh扩增引物为：
42.正向序列(seq id no：4)：5
‘‑
ggagcgagatccctccaaaat-3’；
43.反向序列(seq id no：5)：5
‘‑
ggctgttgtcatacttctcatgg-3’。
44.rt-qpcr反应体系如下表1所示：
45.表1反应体系
[0046][0047]
rt-qpcr反应条件如下表2所示：
[0048]
表2反应条件
[0049][0050][0051]
1.2.2蛋白质免疫共沉淀验证siprkaca转染率
[0052]
收集u87-mg细胞，用预冷的2
×
裂解缓冲液在冰上孵育10～15min。然后，用超声波粉碎裂解液，离心提取总蛋白。采用bca法(beyotime)测定蛋白质浓度。取50μg蛋白质样品用10％十二烷基硫酸钠-page分离，转移到聚偏二氟乙烯微孔膜上，用含5％脱脂奶粉的tbst封闭1h，用一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育2h，包括抗prkaca(1：100，santa cruz)、抗β-actin(1：2,000，abcam)。带有辣根过氧化物酶标签二抗(1：10000)购自cst。用ecl-plus试剂盒(thermo)检测免疫反应条带。
[0053]
结果如图1所示，转染siprkaca后u87-mg细胞中prkaca mrna表达水平和蛋白表达水平均降低。
[0054]
1.3cck-8实验检测细胞活性
[0055]
将2,000个转染siprkaca细胞接种于96孔板，37℃、5％co2条件下的加湿培养箱中培养。分别于0h、24h、48h、72h、96h后观察细胞生长情况，以未转染siprkaca的细胞作为对照。用细胞计数试剂盒(cck-8，dojindo)在490nm波长处测定od值，检测细胞生长情况。
[0056]
结果如图2所示，转染siprkaca后u87-mg细胞活性降低。
[0057]
1.4细胞迁移实验
[0058]
将1
×
104个转染siprkaca细胞接种在transwell上室不含血清的dmem培养基中，在下室中加入含血清的dmem完全培养基，孵育30h后，固定、染色，在蔡司显微镜下拍照并计数。以未转染siprkaca细胞为对照。
[0059]
结果如图3所示，转染siprkaca后u87-mg细胞迁移数明显减少。
[0060]
1.5细胞克隆形成实验
[0061]
将400个转染siprkaca细胞接种在6孔板上，进行克隆形成实验，37℃、5％co2条件下的加湿培养箱中培养。9天后，用4％甲醛固定，0.1％结晶紫染色，室温下用pbs洗涤。然后，用image j软件对菌落数量进行成像和计数。以未转染siprkaca细胞作为对照。
[0062]
结果如图4所示，转染siprkaca后u87-mg细胞克隆形成数明显减少。
[0063]
实施例3siprkaca联合tmz在治疗脑胶质瘤中的作用
[0064]
(1)siprkaca联合tmz进一步降低细胞活性
[0065]
实验方案同实施例2“cck-8实验检测细胞活性”，区别在于：在培养过程中添加不同浓度tmz(终浓度为0、50μm、100μm、200μm)，在tmz和siprkaca联合使用的基础上培养细胞，检测细胞活性。
[0066]
结果如图5所示，与nc组相比，不同浓度tmz联合siprkaca组的细胞活性均显著降低。
[0067]
(2)siprkaca联合tmz进一步降低细胞克隆形成能力
[0068]
实验方案同实施例2“细胞克隆形成实验”，区别在于：在培养过程中添加不同浓度tmz(终浓度为0、50μm、100μm、200μm)，在tmz和siprkaca联合使用的基础上培养细胞，检测细胞克隆形成能力。
[0069]
结果如图6所示，与nc组相比，不同浓度tmz联合siprkaca组的细胞活性均显著降低。
[0070]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。