枯草芽孢杆菌S16菌株、菌剂及其应用

本发明涉及微生物，特别是涉及枯草芽孢杆菌s16菌株、菌剂及其应用。

背景技术：

1、甜瓜是我国栽培的主要水果之一，种植面积超过48.19万公顷，占世界总面积的52.73％，使我国成为甜瓜生产第一大国。由于甜瓜品种众多，在全国各地形成了各具特色的优势产区，常年连片、大规模种植。近几年来，随着甜瓜需求量的增大，各地甜瓜种植模式逐渐由露地种植转向以塑料大棚和日光温室为主的设施种植。但是由于设施种植的集约化管理、常年连作以及施肥量大等特点，导致的甜瓜土传枯萎病发病现象也愈发严重。据统计，甜瓜枯萎病发病的地块一般会造成甜瓜减产20％～40％，严重时甚至导致绝收。

2、甜瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌(fusarium oxysporum)侵染引起的一种土传病害，目前主要采用化学防治、物理防治、农业防治等手段来防治，但由于这些方法存在污染环境、农药残留以及降低甜瓜品质等弊端，不能达到综合防治的目的，这一系列问题促使人们寻找环境友好、绿色可持续的方法来防治甜瓜枯萎病。

技术实现思路

1、针对甜瓜枯萎病的化学防治、物理防治、农业防治等手段存在污染环境、农药残留以及降低甜瓜品质等弊端的技术问题，本发明提供一株枯草芽孢杆菌s16菌株，由该菌株制成的菌剂及其应用。该枯草芽孢杆菌s16菌株对引起甜瓜枯萎病的尖孢镰刀菌具有显著的拮抗作用，并具有产生脂肽类抑菌物质表活面性素(surfactin)和丰产素(fengycin)的能力，进而能够有效防治甜瓜枯萎病。

2、为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：

3、第一方面，本发明实施例提供一株枯草芽孢杆菌s16菌株，其分类名称为枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)，于2022年8月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为cgmcc no.1.60036；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该枯草芽孢杆菌s16菌株的16s rdna序列如seq id no.1所示。

4、本发明所提供的枯草芽孢杆菌s16菌株从土壤中筛选分离得到，其发酵液对甜瓜枯萎病菌尖孢镰刀菌的生长有显著的抑制作用，其胞外分泌物中含有脂肽类抑菌物质表面活性素(surfactin)和丰产素(fengycin)，具体包括c13-c16surfactin a、c13-c16 fengycinb和c14-c16 fengycin a。

5、此外，该枯草芽孢杆菌s16菌株对于侵染病原菌或未浸染病原菌的甜瓜植株，均具有促进甜瓜植株生长以及激活抗氧化物酶系统的作用，可显著提高过氧化氢酶和过氧化物酶活性，降低丙二醛含量，从而能够间接提高甜瓜植株的抗病性。

6、室内水培试验表明，枯草芽孢杆菌s16菌株可以降低甜瓜枯萎病发病率。

7、该枯草芽孢杆菌s16菌株具有枯草芽孢杆菌共有的耐干燥、耐高温、生长速度快、易于定殖和存活等优点，可以通过制成菌剂、生物肥料等来发挥其防治甜瓜枯萎病的作用，对于实现甜瓜产业可持续发展具有重要的理论和实践意义。

8、第二方面，本发明实施例还提供上述枯草芽孢杆菌s16菌株的发酵液、菌悬液和/或无菌上清液在抑制尖孢镰刀菌生长中的应用。

9、结合第二方面，所述发酵液的制备方法优选采用以下步骤：将活化的枯草芽孢杆菌s16菌株接至装有lb液体培养基中，30～37℃，180～220r/min振荡培养12～16h得到种子液，将种子液按照1％～2％的接种量接种于lb液体培养基中，30～37℃，180～220r/min振荡培养6～48h后，得到所述发酵液；

10、所述菌悬液的制备方法优选采用以下步骤：将所述发酵液采用高速冷冻离心机4℃，8000～10000r/min离心15～20min，收集菌体，采用无菌水重悬至od600＝0.9～1.0，得到所述菌悬液；

11、所述无菌上清液的制备方法优选采用以下步骤：将所述发酵液采用高速冷冻离心机4℃，8000～10000r/min离心15～20min，收集上清液，将上清液过0.22μm滤膜后保存，得到所述无菌上清液。

12、第三方面，本发明实施例还提供上述枯草芽孢杆菌s16菌株在制备脂肽类抑菌物质中的应用。

13、结合第三方面，所述脂肽类抑菌物质包括表面活性素和丰产素。

14、优选地，所述表面活性素包括：c13 surfactin a、c14 surfactin a、c15 surfactina和c16 surfactin a。

15、优选地，所述丰产素包括：c14 fengycin a、c15 fengycin a、c16 fengycin a以及c13 fengycin b、c14 fengycin b、c15 fengycin b和c16 fengycin b。

16、第四方面，本发明实施例还提供上述枯草芽孢杆菌s16菌株在制备防控甜瓜枯萎病的菌剂中的应用。

17、第五方面，本发明实施例还提供一种菌剂，所述菌剂包括上述枯草芽孢杆菌s16菌株的发酵液、菌悬液和无菌上清液中的至少一种。该菌剂可用于甜瓜育苗基质中使用，以降低甜瓜尖孢镰刀菌导致的枯萎病发病率。

18、优选地，发酵液可按以下操作制备：

19、将所述枯草芽孢杆菌菌株s16菌株在lb固体平板培养基上30～37℃培养12～16h，挑取单菌落转接到lb液体培养基中，30～37℃，180～220r/min振荡培养12～48h，形成发酵液，即为菌剂，所述菌剂中枯草芽孢杆菌s16菌株的活菌浓度为1×109～2×109cfu/ml。

20、优选地，发酵液还可按以下操作制备：

21、将活化的枯草芽孢杆菌s16菌株接至装有lb液体培养基中，30～37℃，180～220r/min振荡培养12～16h得到种子液，将种子液按照1％～2％的接种量接种于lb液体培养基中，30～37℃，180～220r/min振荡培养12～48h后，得到所述发酵液。

22、将上述发酵液采用高速冷冻离心机4℃，8000～10000r/min离心15～20min，收集菌体，采用无菌水重悬至od600＝0.9～1.0，即得所述菌悬液；

23、将上述发酵液采用高速冷冻离心机4℃，8000～10000r/min离心15～20min，收集上清液，将上清液过0.22μm滤膜后保存，即得所述无菌上清液。

24、第六方面，本发明实施例还提供上述菌剂在防治甜瓜枯萎病中的应用。

25、本发明具备如下有益效果：该枯草芽孢杆菌s16菌株可以分泌包括c13-c16surfactin a、c13-c16 fengycinb和c14-c16 fengycin a在内的脂肽类抑菌物质，并能抑制枯萎病菌尖孢镰刀菌的生长，还能促进甜瓜植株生长，提高过氧化氢酶和过氧化物酶活性，降低丙二醛含量，对甜瓜枯萎病的防治效果可达，79.6％，且能同时提高果实品质。因此枯草芽孢杆菌s16菌株有望代替化学农药防治甜瓜枯萎病，在农业生产领域对于保护环境、降低农药残留、提高果实品质具有重要意义。