一种噬菌体重组蛋白RecT介导的地衣芽孢杆菌重组系统的构建及应用

一种噬菌体重组蛋白rect介导的地衣芽孢杆菌重组系统的构建及应用
技术领域
1.本发明涉及一种噬菌体重组蛋白rect介导的地衣芽孢杆菌重组系统的构建及应用，属于基因工程技术领域。


背景技术：

2.地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)是一种革兰氏阳性菌，它因为发酵条件简单、酶系丰富、产酶量高和食品安全级菌株等优点而具有很高的应用价值。目前地衣芽孢杆菌已经被广泛应用于工业中生产肽类抗生素(如杆菌肽和蛋白质)、有机酸和聚合物(如柠檬酸、肌苷酸和聚谷氨酸)。此外，地衣芽孢杆菌在水产养殖、农业、生物医学和制药等领域均有重要应用。
3.当前以基因组序列信息为蓝图，基于人工设计的遗传扰动而进行的代谢工程已成为研究地衣芽胞杆菌复杂代谢途径以及进行菌种改造构建相关表型的有效策略。经典的基因编辑策略是通过转化突变盒片段同源替换目标基因即同源重组(homologous recombination，hr)，以实现微生物基因组上目的片段的敲除或整合，如大肠杆菌(escherichia coli)利用自身reca重组系统实现染色体大片段的敲除与整合。随着crispr(成簇的规律间隔短回文重复序列，clustered regularly interspaced short palindromic repeats)系统的发现，基于crispr-cas9的基因编辑工具是近年来的一大热点。li kaifeng等人利用cas9的蛋白突变体crispr-cas9n系统实现了地衣芽孢杆菌yvmc基因的敲除，在cas9n对dna单链进行剪切产生断裂后，再依靠同源互补片段的整合完成目的基因的插入(li k.f.,cai d.b.,wang z.q.,he z.l.,and chen s.w.,2018,development of an efficient genome editing tool in bacillus licheniformis using crispr-cas9 nickase,appl.environ.microbiol.,84(6):e02608-17.)。在此技术中，同源重组的效率是基因编辑的限速步骤。李宗文利用温敏质粒为载体，构建敲除质粒介导同源双交换来失活α-淀粉酶基因，后续通过flp/frt重组酶删除用来筛选的抗性标记(李宗文，李由然，顾正华，丁重阳，张梁，徐沙，石贵阳，2019，地衣芽孢杆菌flp/frt基因编辑系统的构建及验证，生物工程学报，35(3)：458-471.)。该基因编辑方法仍依赖于同源重组机制，因此重组效率是现有基因编辑技术成功的关键。
4.然而现有的地衣芽孢杆菌基因敲除方法主要依赖于细菌内源性重组系统，敲除效率极低，依靠地衣芽孢杆菌自身几乎无法实现基因敲除或外源基因的引入，限制了其菌种选育和工业应用，亟待开发简便高效的上游改造工具。


技术实现要素：

5.本发明提供了一种噬菌体重组蛋白rect介导的地衣芽孢杆菌异源重组系统，可高效地实现基因的敲除，为地衣芽孢杆菌的代谢工程改造提供了有效的技术手段。
6.本发明提供了一种重组质粒，含有鼠李糖诱导型启动子p
rha
和芽孢杆菌噬菌体
(bacillus phage)049ml001来源的重组蛋白rect；所述鼠李糖诱导型启动子p
rha
调控所述重组蛋白rect的表达。
7.在一种实施方式中，所述鼠李糖诱导型启动子p
rha
的核苷酸序列如seq id no.1所示。
8.在一种实施方式中，所述重组蛋白rect含有seq id no.2所示的氨基酸序列。
9.在一种实施方式中，所述重组蛋白rect的编码基因如seq id no.3所示。
10.在一种实施方式中，所述重组质粒以大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒phy-plk300为出发质粒。
11.本发明提供了芽孢杆菌噬菌体(bacillus phage)049ml001来源的重组蛋白rect在地衣芽孢杆菌中基因编辑方面的应用。
12.在一种实施方式中，所述基因编辑包括但不限于基因的敲除。
13.在一种实施方式中，所述应用包括如下步骤：
14.(1)构建待敲除的靶基因的基因敲除盒；所述基因敲除盒含有靶基因上游片段、抗性基因、靶基因下游片段；
15.(2)将所述基因敲除盒连接至所述鼠李糖诱导型启动子p
rha
的上游；
16.(3)将步骤(2)构建的重组质粒转化至宿主细胞中，获得重组菌；
17.(4)将步骤(3)获得的重组菌在含抗性基因相应抗生素的培养基中培养一段时间，加入鼠李糖诱导所述重组蛋白rect的表达。
18.在一种实施方式中，所述靶基因为α-淀粉酶基因amyl，用于敲除靶基因的淀粉酶基因敲除盒具有如seq id no.4所示的核苷酸序列。
19.上述的重组系统基因敲除的具体方法如下：
20.(1)重组菌株转接到添加四环素抗性的15ml lb培养基中，37℃、200rpm培养至足够菌浓。
21.(2)添加鼠李糖诱导启动子p
rha
表达重组酶rect，37℃、200rpm继续培养一段时间。
22.(3)取菌液用无菌水稀释10-5-10-7
后涂布敲除盒抗性平板，平板置于37℃培养箱培养至长出单菌落。
23.(4)挑取单菌落进行菌落pcr，筛选成功敲除目的基因的菌株。
24.在一种实施方式中，所述步骤(4)是将重组菌株在含抗生素的lb培养基中，于30～37℃、培养2～10h后，添加5～20g/l的鼠李糖诱导重组酶rect，于28～37℃继续培养12～36h。
25.在一种实施方式中，重复步骤(4)的操作传代1～3次。
26.本发明还要求保护所述重组质粒或所述噬菌体重组蛋白rect介导的地衣芽孢杆菌异源重组系统在地衣芽孢杆菌基因敲除方面的应用。
27.有益效果：本发明首次在地衣芽孢杆菌中利用重组酶rect介导的重组系统进行基因编辑，并且通过重组酶作用条件的优化，显著提高了地衣芽孢杆菌的基因编辑效率。本技术引入异源重组酶，规避了细菌自身对基因重组的严密调控，显著提高了重组效率。本系统的重组效率相比于地衣芽孢杆菌自身的重组效率10-6
，提高了105倍。将构建的基因敲除系统应用于α-淀粉酶基因amyl的敲除，重组效率可达5.56％～16.67％。
附图说明
28.图1：敲除质粒pka。
29.图2：带有重组酶rect表达盒的amyl基因敲除质粒pkar。
30.图3：重组系统敲除amyl基因双交换原理图。
31.图4：重组系统敲除amyl基因菌落pcr核酸电泳图。
32.图5：重组系统敲除amyl基因效率图。
33.图6：重组系统作用条件的优化；a：诱导时间对重组效率的影响；b：诱导剂浓度对重组效率的影响；c：培养时间对重组效率的影响；d：传代次数对重组效率的影响。
具体实施方式
34.lb培养基：蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、nacl 10g/l(固体培养基加1.5％的琼脂粉)。
35.重组效率的计算方法：(阳性转化子个数
÷
挑取的单菌落个数)
×
100％。
36.实施例涉及的引物序列如表1所示。
37.表1引物及序列
[0038][0039]
注：引物携带的酶切位点用下底横线标出。
[0040]
实施例1：敲除质粒pka的构建
[0041]
选取b.licheniformis cicim b1391α-淀粉酶(α-amylase)基因amyl(genbank登录号：cp005965.1region:723302..724840)为敲除试验基因。以质粒pnztt-afkf(公开于论文《地衣芽孢杆菌flp/frt基因编辑系统的构建及验证》)为模板，利用引物amyl-hind
ⅲ‑
f、amyl-ecor
ⅰ‑
r扩增amyl敲除盒片段(seq id no.4所示)，纯化后用hindⅲ和ecorⅰ双酶切，将酶切产物与经相同双酶切的质粒phy-plk300连接，构建得到α-淀粉酶基因敲除质粒pka(图1)。
[0042]
实施例2：带有重组酶rect表达盒的敲除质粒pkar的构建
[0043]
重组酶rect基因序列由上海生工生物工程有限公司合成，利用引物rect-xho
ⅰ‑
f、rect-ecor
ⅰ‑
r扩增seq id no.3所示的重组酶rect基因片段；以b.licheniformis cicim b1391为模板，利用引物p
rha-ecor
ⅰ‑
f、p
rha-xho
ⅰ‑
r扩增鼠李糖启动子p
rha
片段(seq id no.1所示)，将p
rha
片段和重组酶rect基因片段通过重叠延伸pcr得到重组酶rect表达盒，纯化后用ecorⅰ单酶切，连接到经相同单酶切的实施例1构建的质粒pka上，得到带有重组酶rect表达盒的α-淀粉酶基因敲除质粒pkar(图2)。
[0044]
实施例3：在地衣芽孢杆菌中应用敲除质粒敲除amyl基因
[0045]
将实施例2构建的α-淀粉酶基因敲除质粒pkar转化至地衣芽孢杆菌cicim b1391，得到重组地衣芽孢杆菌。将构建获得的重组地衣芽孢杆菌转接到添加四环素抗性的15ml lb培养基，在37℃、200rpm的条件下培养8h后加入终浓度为10g/l的鼠李糖继续37℃培养，诱导p
rha
表达重组酶rect，继续于37℃、200rpm培养一段时间，取菌液用无菌水稀释10-5-10-7
涂布卡那霉素抗性平板，平板置于37℃培养箱培养至长出单菌落；同时取500μl菌液至新的添加四环素抗性的15ml lb培养基，以相同的条件传代培养，稀释后涂布卡那霉素抗性平板。
[0046]
挑取平板上一定数量的单菌落，利用敲除验证引物amyl-yz-f/amyl-yz-r进行菌落pcr验证，筛选阳性转化子。菌株在同源重组的过程中，会发生一侧同源臂成功替换基因组上的同源片段从而将整个重组质粒整合到细菌基因组上，此过程称为单交换。当另一侧同源臂再次重组，将人为设计的目的片段插入到基因组的目标位点上，此时完成双交换即成功同源重组，实现基因的敲除，原理如图3所示。未成功重组的菌株经过菌落pcr将会得到原始菌株基因组1947bp的条带或无条带，当菌落pcr得到的条带为2649bp时与理论大小一致，说明amyl基因被成功敲除(图4)。
[0047]
没有重组酶rect的敲除质粒pka及未添加鼠李糖诱导重组酶rect表达的质粒pkar在重组过程中均未筛选到成功敲除amyl基因的阳性转化子，重组效率为0。使用本发明中重组系统直接敲除amyl基因的效率可达5.56％(图5)。
[0048]
实施例4：启动子诱导时间对重组效率的影响
[0049]
将实施例2构建的重组地衣芽孢杆菌转接到添加四环素抗性的15ml lb培养基，在37℃、200rpm的条件下分别培养2、4、6、8和10h后，添加终浓度为10g/l的鼠李糖，诱导重组酶表达后继续培养12h，取菌液稀释后涂布卡那霉素抗性平板，菌落pcr筛选成功重组的菌株。当鼠李糖的添加时间为菌株生长8h时，筛选得到敲除成功的转化子最多，计算得到重组效率为6.25％(图6a)。
[0050]
实施例5：诱导剂浓度对重组效率的影响
[0051]
将实施例2构建的重组地衣芽孢杆菌转接到添加四环素抗性的15ml lb培养基，在37℃、200rpm的条件下培养8h后，分别添加按终浓度计，5g/l，10g/l，15g/l，20g/l的鼠李糖诱导启动子的调控。添加诱导剂后继续37℃、200rpm培养12h，取菌液稀释后涂布卡那霉素抗性平板，菌落pcr筛选成功重组的菌株。当诱导剂浓度低于1％时，未筛选到阳性转化子；诱导剂的添加量为1.5％时，筛选到的阳性转化子最多，计算得到重组效率为6.94％(图6b)。
[0052]
实施例6：菌株培养时间对重组效率的影响
[0053]
将实施例2构建的重组地衣芽孢杆菌转接到添加四环素抗性的15ml lb培养基，在37℃、200rpm的条件下培养8h后，添加终浓度为15g/l鼠李糖诱导启动子的调控，添加诱导剂后控制37℃、200rpm培养时间分别为12、18、24、30和36h，取菌液稀释后涂布卡那霉素抗性平板菌落pcr筛选成功重组的菌株。当诱导后的培养时间为24h筛选到的阳性转化子最多，计算得到重组效率为9.64％(图6c)。
[0054]
实施例7：传代次数对重组效率的影响
[0055]
将实施例2构建的重组地衣芽孢杆菌转接到添加四环素抗性的15ml lb培养基，在37℃、200rpm的条件下培养8h后加入1.5％浓度的鼠李糖诱导p
rha
表达重组酶rect，继续37
℃、200rpm培养24h后，取500μl菌液至新的添加四环素抗性的15ml lb培养基，以上述相同的条件传代培养3次，分别取每一次传代培养后的菌液稀释，涂布卡那霉素抗性平板，菌落pcr筛选成功重组的菌株。结果显示在传代3次时，重组效率最高，达到16.67％(图6d)。
[0056]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。