一种多功能重组抗体及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物，涉及一种多功能重组抗体及其制备方法和应用，具体涉及一种能够既识别cd73又具有il15功能的多功能重组抗体及其应用。

背景技术：

1、抗体药物目前已经成为抗癌药物中的一个主要组成部分，但是在实体瘤方面，抗体药物的疗效还是有限的，因此寻找更多的新型实体瘤抗原很重要，但是也相对困难。对于实体瘤治疗而言，要克服提高的疗效，很重要的一个方面就是解除肿瘤微环境(tme)对免疫效应细胞的抑制作用。cd73是5-主核苷酸水解酶，可将细胞外腺苷一磷酸(amp)水解为腺苷，而腺苷是一种功能强大的免疫抑制性分子，能够抑制cd8阳性t细胞的活化，进而帮助癌细胞逃逸t细胞的“追杀”，可以说它是癌症中免疫抑制微环境形成的关键成分之一。据报道，cd73在许多不同的癌症中均有表达，包括结肠癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、膀胱癌、白血病、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、黑色素瘤、甲状腺癌、食道癌、前列腺癌和乳腺癌等。而且，cd73在癌症中的表达与细胞增殖、迁移、新血管形成、侵袭性、转移和患者更短的生存相关。也有人提出cd73活性可作为甲状腺乳头状癌的预后标志物。虽然已经表明cd73可调节肿瘤细胞与细胞和细胞与基质间的相互作用，但cd73的表达和活性也与t细胞反应降低有关，并且有人提出其涉及抗药性。因此，cd73可以直接和间接地调控癌症的发展，这一点体现了其作为新的治疗靶标的潜力，因此通过调控抑制其活性以及研究出相关治疗剂是非常令人期望的。

2、il15是一种由多种细胞表达的细胞因子，这些细胞包括单核细胞、巨噬细胞、表皮细胞和成纤维细胞等，但t淋巴细胞则不表达。与其他多种细胞因子不同，il15一般不分泌出细胞发挥作用，而是与il15rα组合后定位在特定的细胞膜，从而刺激附近的效应细胞，主要是nk和cd8+t细胞。il15与il2关系密切，il15与il15rα形成复合物后可以与il2共用的β/γ受体结合，介导其生物学活性。在抗肿瘤作用方面，il15比il2的一个优势是il15/rα不会刺激treg的增殖。目前，有多种il15相关的分子在研发阶段用于治疗恶性肿瘤。其中进展最快的是alt-803，其分子由il15和il15rαsushi-hfc1形成的复合物。多个临床研究显示，alt-803对包括黑色素瘤在内的多种肿瘤有效，但同时会出现严重的毒副作用，主要包括肝功能损害，低血压和发烧等。

3、开发一种能够杀伤多种癌症细胞且毒副作用小的药物有重要的意义。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明的目的是提供一种够特异性识别cd73蛋白的单克隆抗体、分泌所述单克隆抗体的杂交瘤细胞；以及由所述的单克隆抗体经过人源化改造得到重组抗体；以及既能够识别人cd73蛋白，又具有il15功能的多功能重组抗体。

2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种单克隆抗体，所述单克隆抗体能够识别人cd73-ecd蛋白；所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no：5所示，所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no：7所示。

3、本发明通过用重组表达的人cd73-ecd蛋白免疫小鼠制备了能够特异性识别人cd73蛋白的鼠源单克隆抗体，命名为3e10。通过生物学分析，得到所述鼠源单克隆抗体的重链可变区及轻链可变区的氨基酸序列。

4、进一步地，本发明还要求保护一种重组抗体，所述重组抗体由所述的单克隆抗体3e10经过人源化得到，所述重组抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no：16所示，所述重组抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no：18所示。

5、作为本发明的优选实施方式，所述重组抗体的重链氨基酸序列如seq id no：17所示，所述重组抗体的轻链氨基酸序列如seq id no：19所示。

6、本发明发明人对所得到鼠源单克隆抗体3e10序列进行进一步分析，替换人源模板的cdr区，重链可变区再与人igg1恒定区重组，轻链可变区与人的kappa链恒定区重组，同时以该抗体的三维结构为基础，对包埋残基、与cdr区有直接相互作用的残基，以及对各抗体的vl和vh的构象有重要影响的残基进行回复突变，最终获得人源化重组抗体，命名为hu3e10。所述人源化重组抗体hu3e10重链可变区及轻链可变区的氨基酸序列、重链氨基酸序、轻链氨基酸序列如上述所示。

7、进一步地，本发明还要求保护一种多功能重组抗体，所述多功能重组抗体的重链包括识别人cd73的抗体功能区、人igg1恒定区功能域、il15功能区，以及用于连接各功能区的非功能性氨基酸片段；所述识别人cd73的抗体功能区的氨基酸序列包括所述重组抗体的重链可变区氨基酸序列。

8、所述il15功能区可识别人il2/il15β/γ受体的功能域。

9、本发明发明人进一步改造了上述得到的人源化抗体，将抗体重链序列与具有il15功能的序列相连接，进一步得到既能够识别人cd73蛋白，又具有il15功能的重组抗体。

10、作为本发明的优选实施方式，所述人igg1恒定区功能域为人igg1恒定区，氨基酸序列如seq id no：8所示。

11、更优选地，所述人igg1恒定区功能域为突变的人igg1恒定区，所述突变的人igg1恒定区氨基酸序列如seq id no：24所示。

12、本发明发明人通过使用含有突变的人igg1恒定区的序列，得到的多功能重组抗体代谢周期更短，毒副作用更低，安全性更佳。

13、作为本发明的优选实施方式，所述人il15功能区的氨基酸序列如seq id no：21所示。

14、更优选地，所述人il15功能区的氨基酸序列如seq id no：22所示。

15、seq id no：22所示的优选人il15的功能区的氨基酸序列为人il15rsushi与人il15通过(ggggs)6连接形成单链il15，即il15sc。

16、作为本发明的优选实施方式，所述多功能重组抗体中用于连接各功能区的非功能性氨基酸片段为ggggs重复。

17、更优选地，所述ggggs重复为(ggggs)3。

18、作为本发明的优选实施方式，所述多功能重组抗体的人igg1恒定区功能域氨基酸序列如seq id no：8；所述多功能重组抗体的重链氨基酸序列如seq id no：23所示；所述多功能重组抗体轻链氨基酸序列如seq id no：19所示。

19、本发明制备了一种能够识别cd73并具有il15功能的多功能抗体，命名为spgl003。

20、更优选地，所述多功能重组抗体的人igg1恒定区功能域为突变的人igg1恒定区，所述突变的人igg1恒定区氨基酸序列如seq id no：24所示；所述多功能重组抗体的重链氨基酸序列如seq id no：26所示；所述多功能重组抗体轻链氨基酸序列如seq id no：19所示。

21、利用所述优选的多功能重组抗体序列制备得到的多功能重组抗体包含突变的人igg1恒定区的序列，命名为spgl004；多功能重组抗体spgl004不仅能够有效识别多种肿瘤细胞中的cd73，能有效抑制多种癌细胞生长，且半衰期更短，毒性更低，安全性好。

22、进一步地，本发明还要求保护编码所述单克隆抗体，或所述重组抗体，或所述多功能重组抗体的核苷酸序列。

23、根据提供所述单克隆抗体，或所述重组抗体，或所述多功能重组抗体的氨基酸序列可得到相应的编码基因的核苷酸序列。

24、作为本发明的优选实施方式，所述单克隆抗体的重链可变区核苷酸序列如seq idno：4所示，轻链可变区核苷酸序列如seq id no：6所示。

25、进一步地，本发明还要求保护包含所述的核苷酸序列的表达载体。

26、通过分子生物学的方法，可构建得到含有所述的核苷酸序列的表达载体。

27、进一步地，本发明还要求保护包含所述的表达载体的宿主细胞。

28、通过细胞生物学的方法，可利用所述表达载体构建得到能够有效表达所述抗体蛋白的宿主细胞。

29、进一步地，本发明还要求保护所述单克隆抗体，或所述重组抗体，或多功能重组抗体；或所述核苷酸序列，或所述表达载体，或所述宿主细胞在制备用于治疗肿瘤的生物制剂的应用。

30、进一步地，本发明还要求保护一种生物制剂，所述生物制剂包括所述单克隆抗体，或所述重组抗体，或所述多功能重组抗体；或所述核苷酸序列，或所述表达载体，或所述宿主细胞中的至少一种。

31、进一步地，本发明还提供了所述单克隆抗体或所述的重组抗体，或所述多功能重组抗体的制备方法，包括以下步骤：

32、(1)通过人工合成或分子生物学方法得到含所述单克隆抗体或重组抗体或多功能重组抗体的基因片段的表达载体；

33、(2)将所述表达载体转染至细胞进行蛋白表达；

34、(3)通过蛋白纯化得到所述单克隆抗体或重组抗体或多功能重组抗体。

35、通过分别构建含有将上述抗体的重链或轻链序列的表达载体，转染合适的细胞进行表达和纯化，即可获得相应的抗体。

36、作为本发明的优选实施方式，所述步骤(1)中，通过分子生物学制备含所述单克隆抗体或重组抗体或多功能重组抗体的基因片段的表达载体为：将所述抗体的重链或轻链核苷酸序列插入至pcdna3.4表达载体。

37、作为本发明的优选实施方式，所述步骤(2)中，用于蛋白表达的细胞为expi-293f细胞。

38、作为本发明的优选实施方式，所述步骤(3)中的蛋白纯化方法为通过protein g纯化。

39、本发明与现有技术相比，具有如下技术效果：

40、本发明不仅制备了一种能够特异性识别人cd73蛋白的单克隆抗体，还提供了其人源化的重组抗体。并在此基础上，发明人进一步利用cd73特异性重组抗体制备了既能够识别人cd73，又具有il15功能的多功能重组抗体，能够有效增强原抗体对肿瘤细胞的杀伤作用。进一步地，本发明还通过引入突变的人igg1恒定区，得到一种改构的特异性cd73单抗-il15双功能分子，该分子在保持体内抗肿瘤活性的同时，可有效缩短其代谢周期，从而降低了其在体内的毒副作用，大大提高了安全性。本发明的多功能重组抗体能够识别多种肿瘤细胞内的cd73，具有巨大的应用前景。