一种磁珠法全血基因组DNA提取试剂盒的制作方法

一种磁珠法全血基因组dna提取试剂盒
技术领域
1.本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种磁珠法全血基因组dna提取试剂盒。


背景技术：

2.在分子生物学实验中，核酸提取是一项最基本且最重要的环节，核酸提取的产量、纯度及完整性直接关系到下游核酸检测、生物学研究或其他新产品开发的成败。磁珠法核酸提取方法是指以超顺磁性氧化硅纳米磁性微珠(以下简称磁珠)为载体，通过磁珠在高盐溶液中吸附核酸，经过磁性分离和漂洗杂质后，在低盐溶液中核酸从磁珠表面解吸附的原理进行核酸提取的方法。该方法不需离心，操作简单，便于高通量、自动化操作，可以使核酸提取效率显著升高，已成为目前新兴的核酸提取技术。
3.目前基因组dna提取纯化的方法有很多种，如苯酚氯仿抽提法、sds法、离心柱法等，但上述方法存在提取试剂有毒，操作繁琐，易导致污染等问题，而磁珠法不使用有毒试剂，操作简单，不易污染，已经成为目前分子生物学和临床检验医学研究的理想方法。
4.但是现有磁珠法基因组dna提取试剂盒对全血基因组dna的适配度低，提取率还有待提高。


技术实现要素：

5.本发明提供一种能够高效提取全血基因组dna的磁珠法核酸提取试剂盒，具体的，本发明的技术方案如下：
6.一种磁珠法全血基因组dna提取试剂盒，包括裂解液、磁珠、蛋白酶k溶液、清洗液i、清洗液ii、洗脱液，其中：
7.所述裂解液的成分和含量如下：
[0008][0009]
所述磁珠为超顺磁性氧化硅纳米磁性微珠；
[0010]
所述清洗液i的成分和含量如下：
[0011][0012]
所述清洗液ii为70％乙醇；
[0013]
所述洗脱液的成分和含量如下：
[0014]
缓冲液
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.04-0.05mol/l
[0015]
亚氨基二琥珀酸四钠
ꢀꢀꢀ
0.004-0.04mol/l；
[0016]
所述蛋白酶k溶液的成分和含量如下：
[0017]
蛋白酶k
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
10-20mg/ml。
[0018]
进一步的，所述非离子表面活性剂为np-40、tween-20、triton-x100中的至少一种。
[0019]
进一步的，所述缓冲液为ph7.0-8.0tris-hcl、磷酸缓冲液中的一种。
[0020]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0021]
1.本发明的磁珠法全血基因组dna提取试剂盒添加多聚腺苷酸，极大提高所提取核酸纯度和稳定性，a260/a280为1.8-2.0，a260/a230》2.0，有利于pcr、southern、rflp等下游实验的顺利进行。
[0022]
2.使用亚氨基二琥珀酸四钠可以更高效破坏细胞膜结构，并更加高效、快速的螯合金属离子。在含有表面活性剂的体系中，加入一定含量的卡波姆2020，增加溶液的稳定性，可以提高配方的耐电解性和高ph值适应性。
[0023]
3.本发明的磁珠法全血基因组dna提取试剂盒可以快速、简单、通用的从血液、唾液、鼻液、真菌，动物组织，细菌等样本中分离纯化核酸，实现多体系通用提取，克服了现有试剂盒适配度低，提取率低等问题。
附图说明
[0024]
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
[0025]
图1为本发明的磁珠法全血基因组dna提取试剂盒中实施例1从血液中提取基因组dna产物的电泳胶图以及对照组取基因组dna产物的电泳胶图(孔道1：marker，孔道2-6：实施例1，5个平行，孔道7-11：对照组，5个平行)；
[0026]
图2为本发明的磁珠法全血基因组dna提取试剂盒以及对照组中实施例1提取的健康人血液dna作为模板，扩增人内参rp30基因片段的荧光扩增曲线图。
具体实施方式
[0027]
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例和附图进行详细描述。
[0028]
实施例1
[0029]
本实施例的一种磁珠法全血基因组dna提取试剂盒，其裂解液、清洗液i、清洗液ii、洗脱液按以下配方配制，磁珠购自洛阳吉恩特生物科技有限公司。其中：
[0030]
裂解液的成分和含量如下：
[0031]
[0032][0033]
清洗液i的成分和含量如下：
[0034][0035]
清洗液ii为70％乙醇。
[0036]
洗脱液的成分和含量如下：
[0037]
ph7.0-8.0tris-hcl
ꢀꢀꢀꢀ
0.04mol/l
[0038]
亚氨基二琥珀酸四钠
ꢀꢀꢀ
0.01mol/l
[0039]
所述蛋白酶k的成分和含量如下：
[0040]
蛋白酶k
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
20mg/ml
[0041]
实验1：从人血液中提取基因组dna
[0042]
本实施例的样本准备过程如下：样本新鲜或冻存的人血，本发明所有试剂均使用1
‰
depc处理的超纯水配制，所有耗材均无dna/rna酶污染。
[0043]
具体过程：取准备的人类血液加入到预分装的96深孔板中。
[0044]
按以下表格预分装实施例1的试剂盒组分：
[0045]
表1孔位组分分布
[0046][0047]
分别添加200ul全血和20ul蛋白酶k溶液到a1～h1/a7～h7孔中，5个重复，使用山东博弘基因科技有限公司的bnp32核酸提取仪。提取程序如下：
[0048]
表2提取步骤及参数设置
[0049][0050][0051]
提取完成后，取a5～h5/a11～h11相应孔位的洗脱液得到血液基因组dna。
[0052]
对照组
[0053]
上海尚宝生物科技有限公司全血基因组dna提取试剂盒26238，按照其说明书相关说明进行相应操作提取，提取后的血液基因组dna吸取到1.5ml离心管中备用。
[0054]
用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，琼脂糖购自全式金(货号gs201-01)，荧光核酸染色试剂购自全式金(货号gs101-01)，marker，购自全式金(货号bm311-01)，电压200v，电流150ma，运行45min。
[0055]
结果表明：使用本发明提取的全血基因组dna优于对照组的提取结果(图1)。
[0056]
实验2：以人血液中提取基因组dna为模板进行sybr green pcr实验，如下：
[0057]
以提取得到的全血基因组dna为模板，使用sybr green pcr实验。2
×
sybr green pcr mix是采用sybr green i嵌合荧光法进行real time pcr的专用试剂，购自索莱宝(货号sr1110)。按试剂盒说明书配制反应体系：2
×
sybr green pcrmix 12.5μl，上游引物1ul，
下游引物1ul，提取好的全血基因组dna 5μl，无核酸酶水5.5ul,共25ul体系。使用abi7500荧光定量pcr仪进行实时荧光rt-pcr反应，反应程序如下：
[0058][0059]
rp30内参基因的引物对序列见下表：
[0060]
表3rp30内参基因的引物对序列
[0061]
rp30-fcaagtaagtttctccgaatcccrp30-rgctgaagtcccatgaccgt
[0062]
结果表明：使用本发明提取的全血基因组dna，其ct值小于对照组，表明本发明提取的全血基因组dna浓度高于对照组(图2)。