FUS蛋白在作为融合标签中的应用，重组蛋白及其表达方法与流程

本发明涉及生物，尤其涉及一种fus蛋白在作为融合标签中的应用，重组蛋白及其表达方法。

背景技术：

1、利用植物生物反应器来大规模生产重组蛋白或多肽已被证实为富有前景的系统，相较于传统微生物和哺乳动物生物反应器，植物生物反应器有着低成本、高产量、风险低、规模化容易等优势，已经有多种有价值的重组治疗蛋白或非药用蛋白在植物中表达并得到商业化应用。为了进一步发展植物反应器，来自植物样品的目标蛋白的下游纯化(估计占治疗蛋白情况中生产成本的80％)，是植物生物反应器大规模工业生产重组蛋白中的关键因素。

2、传统的蛋白纯化方法涉及以融合有亲和标签的融合形式表达目标蛋白，亲和标签包括多聚组氨酸、谷胱甘肽s-转移酶、麦芽糖结合蛋白、几丁质结合结构域、c-myc、strepii、钙调蛋白结合肽等。已出现若干种简化下游蛋白纯化的新策略。油质蛋白(oleosin)融合使所需蛋白质靶向至可从水溶性部分容易分离的油体。疏水蛋白(hydrophobin-i，hfbi)融合改变融合蛋白的疏水性，有利于通过基于表面活性剂的两相系统的纯化。融合有γ-玉米醇溶蛋白结构域(zera)使重组蛋白形成紧密、er-定位的蛋白颗粒(protein bodies，pbs)。类弹性蛋白(elp)由重复的五肽(vpgxg)(x是除脯氨酸外的任何氨基酸)组成，具有温度敏感性相变性质。当温度升高至其转变温度(tt)时，可溶性elp会聚集成不可溶相，通过离心即可沉淀分离。当添加冷缓冲液时，可使聚集的elp重溶并回复到可溶相。上述zera、elp和hydrophobin-i三种标签都含有疏水区，有利于标签及其融合蛋白通过自组装的方式形成pbs(plant biotechnol.j.2017.15:671–673)。

3、渐冻人症关键致病蛋白fus(fused in sarcoma)在转录调控、rna代谢和dna损伤反应中起到关键作用。fus突变与肌萎缩侧索硬化症(als)和罕见的额颞叶痴呆(frontotemporal lobar dementia,ftld)相关。fus氨基端低复杂度的类朊病毒样结构域(prion-like lc domains)可在无细胞培养基中通过液-液相分离形成高度可逆的纤维状淀粉样蛋白。外界压力刺激或疾病相关突变会促使相关致病蛋白动态相分离调控紊乱，导致蛋白进行液-固相转化并产生高度稳定的致病淀粉样聚集体。这种高度稳定的病理性淀粉样聚集体的产生和传播与相应疾病的发展密切相关。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种fus蛋白在作为融合标签中的应用，重组蛋白及其表达方法。由于fus蛋白具有液-液相分离及自组装特性，本发明首次利用fus蛋白作为融合标签，在植物中表达重组蛋白，我们发现fus蛋白融合蛋白可以在烟草叶中形成蛋白颗粒，使形成的蛋白聚集在一起，从而减小蛋白对植物细胞的毒性，延长植物生产该蛋白的周期，增大产量。纯化时可通过控制ph使其分离出来，方法简单，纯度高，成本低。

2、为了实现上述目的，本发明提供了一种fus蛋白在作为融合标签中的应用。

3、基于一个总的技术构思，本发明还提供了一种重组蛋白，所述重组蛋白，包括：

4、a)编码fus蛋白的核苷酸序列的第一核酸元件；

5、b)编码能够被酶或化学方法切割的核苷酸序列的第二核酸元件；

6、c)编码多肽或蛋白质的靶序列的第三核酸元件；

7、所述第一核酸元件的3’端与所述第二核酸元件的5’端相连，且所述第二核酸元件的3’端与所述第三核酸元件的5’端相连；

8、所述第三核酸元件的3’端与所述第二核酸元件的5’端相连，且所述第二核酸元件的3’端与所述第一核酸元件的5’端相连；

9、所述第一核酸元件、第二核酸元件、第三核酸元件处于同一个阅读框。

10、基于一个总的技术构思，本发明还提供了一种重组蛋白，所述重组蛋白，包括：

11、a)编码fus的核苷酸序列的第一核酸元件；

12、b)编码多肽或蛋白质的靶序列的第三核酸元件；

13、所述第一核酸元件的3’端与所述第三核酸元件的5’端相连，所述第三核酸元件的3’端与所述第一核酸元件的5’端相连，形成了可被酶或者化学试剂特异切割的位点，所述第一核酸元件、第三核酸元件处于同一个阅读框。

14、上述的重组蛋白，进一步的，所述fus蛋白为fl、fpld、fpge或frb；

15、所述fl如seq id no.1所示；

16、所述fpld如seq id no.2所示；

17、所述fpge如seq id no.3所示；

18、所述frb如seq id no.4所示。

19、上述的重组蛋白，进一步的，所述被酶切割的核苷酸序列中，所述酶包括肠激酶、内肽酶arg-c、内肽酶glu-c、内肽酶lys-c、凝血因子xa、内含肽ssp dnab、内含肽sce vma1等；

20、所述被化学方法切割的核苷酸序列中，化学方法包括溴化氰切割。

21、上述的重组蛋白，进一步的，所述第三核酸元件为dsred或sam。

22、基于一个总的技术构思，本发明还提供了一种所述的重组蛋白的表达方法，所述表达方法包括以下步骤：

23、s1、扩增第一核酸元件、第二核酸元件和第三核酸元件的核酸片段；

24、s2、将扩增获得的核酸片段连接在一起，转化至载体中获得重组质粒；

25、s3、将所述重组质粒转化至农杆菌中，筛选阳性克隆；

26、s4、将所述阳性克隆扩大培养获得菌液；

27、s5、将所述菌液通过注射或真空浸渗法转入植物叶片中培养，获得蛋白。

28、上述的表达方法，进一步的，还包括纯化方法，所述纯化方法包括以下步骤：

29、(1)提取植物叶片中的总蛋白，获得总蛋白提取液；

30、(2)将所述总蛋白提取液调节ph至7.5～8.0，使融合蛋白聚集析出，收集的上清即为所述第三核酸元件编码的多肽或蛋白质。

31、与现有技术相比，本发明的优点在于：

32、(1)本发明提供了一种fus蛋白在作为重组蛋白融合标签的应用。fus蛋白具有液-液相分离及自组装特性，本发明首次利用fus蛋白作为融合标签，在植物中表达重组蛋白，我们发现fus融合蛋白可以在烟草叶中形成蛋白颗粒，使形成的蛋白聚集在一起，从而减小靶蛋白对植物细胞的毒性，减轻植物细胞的坏死。

33、(2)本发明提供了一种重组蛋白的表达及纯化方法，由于fus蛋白具有自组装特性，以fus蛋白作为融合标签，在植物中表达重组蛋白时，可以简化下游纯化工艺。

34、(3)本发明提供了一种重组蛋白的表达方法，以fus蛋白为融合标签，使表达的融合蛋白聚集在一起，降低了重组蛋白对细胞的毒性，并减少了植物内源蛋白酶对重组蛋白的降解，从而提高了重组蛋白的表达量。

35、(4)本发明提供了一种重组蛋白的表达方法，其纯化过程通过控制ph使其分离出来，方法简单，纯度高，成本低。