一种水稻秸秆中黄酮和葡聚糖的提取方法与流程

1.本发明属于有机成分提取技术领域，尤其涉及一种水稻秸秆中黄酮和葡聚糖的提取方法。


背景技术：

2.2021年中国水稻种植面积29920千公顷，占粮食作物种植面积的25.44％，是重要的粮食作物之一。水稻秸秆是农作物光合作用的产物，这些产物中有一半以上存在于秸秆中，富含氮、磷、钾、钙、镁和有机质等，是一种具有多用途的可再生的生物资源。水稻秸秆中有95％的干物质，富含粗纤维、粗蛋白、纤维素、半纤维素、木质素等物质。所以水稻秸秆具有广阔的开发利用前景。
3.现阶段对稻草的利用只停留在初级阶段，比如粉碎秸秆还田，作为饲料和食用菌的的营养基质等基础阶段，因为在现有的技术条件下秸秆利用经济价值低，大部分农民为了方便甚至直接焚烧，产生了很多不良后果：1、产生大量有毒有害物质，威胁人与其他生物体的健康。2、破坏土壤结构，造成农田质量下降。3、引发火灾等。针对以上问题我们国家也出台了秸秆禁烧的法律法规。因此对水稻秸秆进行资源利用，具有重要意义。
4.在现有研究中，利用微生物产酶实现作物秸秆降解也是将秸秆资源化利用的主要研究热点之一，并且在制作饲料、制作纸浆、沼气供能、食品化利用方面均有使用。其中在饲料和制作纸浆的加工过程中普遍使用。但由于微生物的木质纤维素降解能力较弱，导致农作物秸秆的水解过程缓慢，水解程度低等不良因素影响，因而限制了秸秆更好的资源化应用于生产生活。
5.因此，如何针对水稻秸秆提出一种高效快速发酵提取技术工艺，以实现秸秆的资源化利用，是当前需要解决的技术问题。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种水稻秸秆中黄酮和葡聚糖的提取方法，通过微生物发酵法+化学法+物理法联合提取，提高水稻秸秆中葡聚糖类和黄酮类物质的提取效率。
7.为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
8.一种水稻秸秆中黄酮和葡聚糖的提取方法，包括以下步骤：利用毕赤酵母发酵菌液浸泡水稻秸秆后倒掉菌液，30-40℃发酵6-48h；将发酵完成的水稻秸秆研磨过筛，加入乙醇溶液，进行超声处理，离心提取含黄酮和葡聚糖的提取液；所述微生物包括泡盛曲霉菌、米曲霉菌、毕赤酵母菌、枯草芽孢杆菌中的一种或几种。
9.优选的是，所述水稻秸秆菌液浸泡前，进行粉碎和高温杀菌，得到灭菌水稻秸秆。
10.优选的是，当微生物为毕赤酵母菌时，所述毕赤酵母发酵菌的培育包括：用接种环将菌接入麦芽汁琼脂培养基中，置于恒温人工气候箱，以25-35℃培养2-6d。
11.优选的是，当微生物为毕赤酵母菌时，所述毕赤酵母发酵菌液的制备包括：用接种
环将菌接入200-400ml的麦芽汁液体培养基中，以30-40℃培养6-48h。
12.优选的是，所述微生物发酵菌液浸泡水稻秸秆1-2h。
13.优选的是，所述研磨2-5min，过60-100目筛。
14.优选的是，所述乙醇溶液体积浓度为50％-80％，料液比为1g：15-25ml。
15.优选的是，所述超声处理功率为120-300w，时间为30-50min。
16.优选的是，所述离心提取包括：3000-6000r/min离心提取2次，10-20min/次，合并2次上清液，得到含黄酮和葡聚糖的提取液。
17.本发明还提供了上述提取方法提取制到的含黄酮和葡聚糖的提取液。
18.相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
19.本发明提供了一种水稻秸秆中黄酮和葡聚糖的提取方法，采取微生物发酵法+物理法+化学法相结合的提取方式，通过优化发酵温度和时间，一定程度上提高了水稻秸秆的发酵效率，进而提升了黄酮和葡聚糖的提取效率。本发明建立了一套发酵效率较高的水稻秸秆资源化利用方法，且成本低，方法简单，为水稻秸秆的进一步资源化利用提供了新途径。
具体实施方式
20.本发明提供了一种水稻秸秆中黄酮和葡聚糖的提取方法，包括以下步骤：利用微生物发酵菌液浸泡水稻秸秆后倒掉菌液，30-40℃发酵6-48h；将发酵完成的水稻秸秆研磨过筛，加入乙醇溶液，进行超声处理，离心提取含黄酮和葡聚糖的提取液；所述微生物包括泡盛曲霉菌、米曲霉菌、毕赤酵母菌、枯草芽孢杆菌中的一种或几种。本发明通过微生物菌液中的木质素酶、纤维素酶等分解水稻秸秆，再通过超声辅助乙醇浸提，即通过“微生物法+化学法+物理法”联合处理水稻秸秆，提升黄酮和葡聚糖的提取效率。本发明进一步优选微生物选用毕赤酵母菌，更优选30℃发酵12h。
21.本发明优选水稻秸秆菌液浸泡前进行预处理，包括：进行粉碎和高温杀菌，得到灭菌水稻秸秆；进一步优选将秸秆粉碎至1-3cm，更优选1cm；进一步优选高温杀菌为121℃，15min灭菌。
22.本发明优选当微生物为毕赤酵母菌时，毕赤酵母发酵菌的培育包括：用接种环将菌接入麦芽汁琼脂培养基中，置于恒温人工气候箱，以25-35℃培养2-6d，进一步优选30℃培养4d。
23.本发明优选当微生物为毕赤酵母菌时，赤酵母发酵菌液的制备包括：用接种环将菌接入200-400ml的麦芽汁液体培养基中，进一步优选250-350ml，更优选300ml；以30-40℃培养6-48h，进一步优选35℃培养，至目标生物酶(木质素酶、纤维素酶等)酶活力达到最高。作为一种可实施方式，本发明制备得到的毕赤酵母发酵菌液，在540nm条件下，测定od值，测定酶活力分别为：木质素酶89.19u/ml、纤维素酶61.62u/ml。
24.本发明优选微生物发酵菌液浸泡水稻秸秆1-2h；进一步优选1.5h。
25.本发明优选浸泡软化后的水稻秸秆研磨2-5min，过60-100目筛；进一步优选研磨3.5min，过80目筛，以提高黄酮和葡聚糖的提取率。
26.本发明优选提取时，乙醇溶液体积浓度为50％-80％，进一步优选70％；料液比为1g：15-25mlml，进一步优选1g：18-22ml，更优选1g：20ml。
27.本发明优选提取时，超声处理功率为120-300w，进一步优选180w；超声时间为30-50min，进一步优选40min。常温提取。
28.本发明优选离心提取包括：3000-6000r/min离心提取2次，进一步优选4000-5000r/min，更优选4500r/min；10-20min/次，进一步优选15min/次；合并2次上清液，得到含黄酮和葡聚糖的提取液。
29.本发明中，若无特殊说明，所述材料及仪器均可由商业途径购得。
30.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
31.实施例1
32.一种水稻秸秆中黄酮和葡聚糖的提取方法，步骤如下：
33.(1)秸秆预处理：将水稻秸秆切碎，长度1-3cm，进行高温高压灭菌，得到灭菌的水稻秸秆；
34.(2)发酵菌种的培育：用接种环将毕赤酵母菌接入麦芽汁琼脂培养基中，置于恒温人工气候箱，以30℃培养4d；
35.(3)发酵菌液的制备：用接种环将毕赤酵母菌接入350ml的麦芽汁液体培养基中，以35℃培养24h；
36.(4)水稻秸秆的软化及发酵：利用发酵菌液浸泡水稻秸秆1.5h，倒掉菌液，35℃发酵24h；
37.(5)黄酮/葡聚糖提取预处理：将发酵后的水稻秸秆研磨3.5min，过80目筛；
38.(6)黄酮/葡聚糖提取：将过筛后的水稻秸秆粉末加入体积浓度为70％乙醇，料液比为1g：20ml，超声处理，超声功率为180w，时间为40min；
39.(7)黄酮/葡聚糖获得：提取完成后，利用离心机4500r/min离心提取2次，15min/次，合并两次上清液，得到含黄酮和葡聚糖的提取液。
40.实施例2
41.一种水稻秸秆中黄酮和葡聚糖的提取方法，步骤如下：
42.(1)秸秆预处理：将水稻秸秆切碎，长度1-3cm，进行高温高压灭菌，得到灭菌的水稻秸秆；
43.(2)发酵菌种的培育：用接种环将毕赤酵母菌接入麦芽汁琼脂培养基中，置于恒温人工气候箱，以25℃培养6d；
44.(3)发酵菌液的制备：用接种环将毕赤酵母菌接入200ml的麦芽汁液体培养基中，以30℃培养48h；
45.(4)水稻秸秆的软化及发酵：利用发酵菌液浸泡水稻秸秆1h，倒掉菌液，40℃发酵6h；
46.(5)黄酮/葡聚糖提取预处理：将发酵后的水稻秸秆研磨2min，过60目筛；
47.(6)黄酮/葡聚糖提取：将过筛后的水稻秸秆粉末加入体积浓度为50％乙醇，料液比为1g：25ml，超声处理，超声功率为130w，时间为50min；
48.(7)黄酮/葡聚糖获得：提取完成后，利用离心机3000r/min离心提取2次，20min/次，合并两次上清液，得到含黄酮和葡聚糖的提取液。
49.实施例3
50.一种水稻秸秆中黄酮和葡聚糖的提取方法，步骤如下：
51.(1)秸秆预处理：将水稻秸秆切碎，长度1-3cm，进行高温高压灭菌，得到灭菌的水稻秸秆；
52.(2)发酵菌种的培育：用接种环将毕赤酵母菌接入麦芽汁琼脂培养基中，置于恒温人工气候箱，以35℃培养2d；
53.(3)发酵菌液的制备：用接种环将毕赤酵母菌接入400ml的麦芽汁液体培养基中，以40℃培养6h；
54.(4)水稻秸秆的软化及发酵：利用发酵菌液浸泡水稻秸秆2h，倒掉菌液，30℃发酵48h；
55.(5)黄酮/葡聚糖提取预处理：将发酵后的水稻秸秆研磨5min，过100目筛；
56.(6)黄酮/葡聚糖提取：将过筛后的水稻秸秆粉末加入体积浓度为80％乙醇，料液比为1g：18ml，超声处理，超声功率为300w，时间为30min；
57.(7)黄酮/葡聚糖获得：提取完成后，利用离心机6000r/min离心提取2次，10min/次，合并两次上清液，得到含黄酮和葡聚糖的提取液。
58.实施例4
59.与实施例1步骤相同，区别在于，选用泡盛曲霉菌菌液发酵秸秆；所述泡盛曲霉菌通过综合pda培养基培养，通过综合pdb液体培养基制备菌液。
60.实施例5
61.与实施例2步骤相同，区别在于，选用米曲霉菌菌液发酵秸秆；所述米曲霉菌通过pda培养基培养，通过pdb液体培养基制备菌液。
62.实施例6
63.不同发酵菌及发酵温度、时间对水稻秸秆提取液中黄酮和葡聚糖含量的影响
64.为了探究微生物法对水稻秸秆发酵的影响，本发明基于泡盛曲霉菌、米曲霉菌、毕赤酵母菌和枯草芽孢杆菌，对发酵微生物进行了筛选，并优化了发酵温度及时间，以提升水稻秸秆中黄酮和葡聚糖的提取效率。
65.1、发酵菌种的培育
66.泡盛曲霉菌(固态)：用接种环将菌接入综合pda培养基中，置于恒温人工气候箱，以25-35℃中培养2-7d；综合pda培养基：马铃薯200g；葡萄糖20g；琼脂15-20g；磷酸二氢钾3g；硫酸镁1.5g；维生素b110mg；蒸馏水1000ml；121℃高压蒸汽灭菌20min。
67.米曲霉菌：用接种环将菌接入pda培养基中，置于恒温人工气候箱，以25-35℃中培养3-5d；pda培养基：马铃薯200g；葡萄糖20g；琼脂15-20g；蒸馏水1000毫升；121℃高压蒸汽灭菌20min。
68.毕赤酵母菌：用接种环将菌接入麦芽汁琼脂培养基中，置于恒温人工气候箱，以25-35℃培养2-6d；麦芽汁琼脂培养基：麦芽汁150ml；琼脂3g；121℃高压蒸汽灭菌20min。
69.枯草芽孢杆菌：用接种环将菌接入营养肉汤琼脂培养基中，置于恒温人工气候箱，以25-40℃培养2-6d；营养肉汤琼脂培养基：营养肉汤培养基100ml；琼脂1.5g；121℃高压蒸汽灭菌20min。
70.2、发酵菌液的制备
71.取菌方法：用接种环分别挑取四种等量的菌块(直径为5mm的圆形菌块)分别接种
于发酵液体培养基中，具体操作步骤如下：
72.泡盛曲霉菌：用接种环将菌接入200-400ml的综合pdb液体培养基中，以30-40℃中培养6-48h；综合pdb液体培养基：马铃薯200g；葡萄糖20g；磷酸二氢钾3g；硫酸镁1.5g；维生素b110mg；定容至1000ml。
73.米曲霉菌：用接种环将菌接入200-400ml的pdb液体培养基中，以30-40℃中培养6-48h；pdb液体培养基：马铃薯200g；葡萄糖20g；定容至1000ml。
74.毕赤酵母菌：用接种环将菌接入200-400ml的麦芽汁液体培养基中，以30-40℃培养6-48h；麦芽汁液体培养基：10-12
°bé
麦芽汁。
75.枯草芽孢杆菌：用接种环将菌接入200-400ml的营养肉汤液体培养基中，以30-40℃培养6-48h；以上培养基的ph值自然。营养肉汤液体培养基：牛肉膏3g；蛋白胨10d；nacl 5g；水1000ml。
76.通过以上培育方式将四种发酵菌种发酵产生目标生物酶(木质素酶、纤维素酶等)，并测定酶活力，保证目标生物酶的浓度达到最高。
77.3、水稻秸秆软化及发酵处理：利用步骤2制得的菌液分别充分浸泡预处理后的水稻秸秆，1h后倒掉菌液，分别在30℃、35℃、40℃条件下发酵6h、12h、24h、48h。每种菌种在不同温度、不同发酵时间条件下分别设置12个处理，三次重复。
78.4、黄酮和葡聚糖的提取与检测：按实施例1记载的方法提取黄酮和葡聚糖，并测定混合液中黄酮和葡聚糖的含量，结果如表1和表2所示；另外，设置乙醇超声提取处理(70％乙醇溶液超声180w浸提48h)为对照，测定提取液中黄酮和葡聚糖的含量，结果如表3所示。
79.黄酮测定方法：alcl
3-naac比色法取2支25ml的洁净的容量瓶，分别移入1ml秸秆提取液、1ml芦丁对照品溶液，再分别加入1.5％的alcl3溶液4ml，1mol
·
l-1
naac溶液8ml，以质量分数为30％的乙醇溶液定容，摇匀后置于30℃水浴中显色反应15min，以试剂为空白，在300-600nm区间进行光谱扫描。
80.葡聚糖测定方法：采用分光光度法，刚果红为显色剂，测定最佳条件为：溶ph为8.0，反应温度为20℃，反应时间为30min，最大吸收波长为550nm。
81.5、试验结果
82.表1不同菌种发酵后的水稻秸秆提取液中黄酮含量
83.[0084][0085]
根据表1可以看出，泡盛曲霉菌：在不同的温度以及发酵时间处理下，秸秆中黄酮含量在0.83-1.19mg/g之间，最大值为30℃、12h处理。米曲霉菌：在不同的温度以及发酵时间处理下，秸秆中黄酮含量在0.94-1.27mg/g之间，最大值为35℃、24h处理。毕赤酵母菌：在不同的温度以及发酵时间处理下，秸秆中黄酮含量在1.28-1.76mg/g之间，最大值为35℃、48h处理。枯草芽孢杆菌：在不同的温度以及发酵时间处理下，秸秆中黄酮含量在0.70-1.07mg/g之间，最大值为40℃、12h处理。
[0086]
表2不同菌种发酵后的水稻秸秆提取液中葡聚糖含量
[0087][0088][0089]
根据表2可以看出，泡盛曲霉菌：在不同的温度以及发酵时间处理下，水稻秸秆中葡聚糖含量在0.05-0.21mg/g之间，最大值为35℃、48h处理。米曲霉菌：在不同的温度以及
发酵时间处理下，水稻秸秆中葡聚糖含量在0.08-0.24mg/g之间，最大值为40℃、6h处理。毕赤酵母菌：在不同的温度以及发酵时间处理下，水稻秸秆中葡聚糖含量在0.18-0.37mg/g之间，最大值为30℃、12h处理。枯草芽孢杆菌：在不同的温度以及发酵时间处理下，水稻秸秆中葡聚糖含量在0.13-0.24mg/g之间，最大值为40℃、6h处理。
[0090]
表3乙醇超声处理提取水稻秸秆提取液中的黄酮和葡聚糖含量
[0091]
提取剂提取时间(h)黄酮含量(mg/g)葡聚糖含量(mg/g)70％乙醇48h0.940.31
[0092]
根据表1、2和表3可以看出，利用特定微生物处理水稻秸秆后，利于黄酮和葡聚糖的提取，尤其对于黄酮，微生物处理后明显提升了黄酮的提取水平，以毕赤酵母菌效果最佳。此外，利用微生物处理水稻秸秆后，乙醇超声处理时间可由48h缩短至40min，大幅缩短了提取时间，提升了提取效率，降低了能源消耗。
[0093]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。