一种靶向冠状病毒RBD蛋白的抗体的制作方法

一种靶向冠状病毒rbd蛋白的抗体
技术领域
1.本发明属于细胞免疫学、分子生物学领域，涉及一种靶向冠状病毒rbd蛋白的抗体。


背景技术：

2.冠状病毒粒子呈不规则形状，直径约60-220nm。病毒粒子外包着脂肪膜，膜表面有三种糖蛋白：刺突糖蛋白(s，spike protein，是受体结合位点、溶细胞作用和主要抗原位点)；小包膜糖蛋白(e，envelope protein，较小，与包膜结合的蛋白)；膜糖蛋白(m，membrane protein，负责营养物质的跨膜运输、新生病毒出芽释放与病毒外包膜的形成)。少数种类还有血凝素糖蛋白(he蛋白，haemaglutinin－esterase)。冠状病毒的核酸为非节段单链(+)rna，长27-31kb，是rna病毒中最长的rna核酸链，具有正链rna特有的重要结构特征：即rna链5’端有甲基化“帽子”，3’端有polya“尾巴”结构。这一结构与真核mrna非常相似，也是其基因组rna自身可以发挥翻译模板作用的重要结构基础，而省去了rna－dna－rna的转录过程。冠状病毒的rna和rna之间重组率非常高，病毒出现变异正是由于这种高重组率。
3.冠状病毒科只感染脊椎动物，与人和动物的许多疾病有关。自1980年在德国召开第一届国际冠状病毒讨论会以来，日益受到医学、兽医学和分子生物学家的广泛重视。这类病毒具有胃肠道、呼吸道和神经系统的嗜性。儿童的冠状病毒感染并不常见。
4.新型冠状病毒感染(corona virus disease 2019，covid-19)是由新型冠状病毒(sars-cov-2)引发的急性呼吸道传染病，在全球各国大规模爆发并急速扩散，目前已成为全球性重大的公共卫生事件，并成为人类历史上致死人数最多的流行病之一。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种靶向冠状病毒rbd蛋白的抗体。
6.为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
7.本发明提供了一种抗rbd蛋白的特异性抗体或其抗原结合片段，其包含第一可变区和第二可变区，其中所述第一可变区是抗体重链可变区，其抗原互补决定区cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分别如seq id no：2，seq id no：3及seq id no：4所示；其中所述第二可变区是抗体轻链可变区，其抗原互补决定区cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分别如seq id no：10，seq id no:11及seq id no：12所示。
8.如本文所述的术语“抗体”以最广义使用，而且具体涵盖例如单克隆抗体，多克隆抗体，具有多表位特异性的抗体，单链抗体，多特异性抗体和抗体片段。此类抗体可以是嵌合的，人源化的，人的和合成的。
9.术语“抗原结合片段”是指由抗体的一部分形成的抗体片段，其包含一或多个cdr或与抗原结合但不包含完整天然抗体结构的任何其它抗体片段。抗原结合片段的实例包括但不限于双功能抗体、fab、fab'、f(ab')2、fv片段、二硫键稳定的fv片段(dsfv)、(dsfv)2、
双特异性dsfv(dsfv dsfv')、二硫键稳定的双功能抗体(ds双功能抗体)、单链抗体分子(scfv)、scfv二聚体(二价双功能抗体)、双特异性抗体、多特异性抗体、骆驼化单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体和二价结构域抗体。抗原结合片段能够结合至与亲本抗体所结合相同的抗原。
10.进一步，所述特异性抗体或抗原结合片段还包括重链可变区框架区fr1、fr2、fr3和fr4，轻链可变区框架区fr1、fr2、fr3和fr4，其中，重链可变区框架区fr1、fr2、fr3和fr4的氨基酸序列分别如seq id no：5、6、7、8所示；轻链可变区框架区fr1、fr2、fr3和fr4的氨基酸序列分别如seq id no：13、14、15、16所示。
11.进一步，所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no：9所示。
12.进一步，所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no：17所示。
13.进一步，所述特异性抗体或抗原结合片段包含重链恒定区和轻链恒定区。
14.本文所用的术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中成为互补决定区(cdr)或超变区中的三个片段中。
15.本发明提供了如下任一项所述的物质：
16.1)一种分离的多核苷酸分子或包含其的表达载体，所述多核苷酸分子编码前面所述的特异性抗体或其抗原结合片段。
17.术语“载体”是指可以将编码蛋白质的多核苷酸可操作地插入其中以引起所述蛋白质表达的媒介物。载体可用于转化、转导或转染宿主细胞，以使其在宿主细胞内表达携带的遗传元件。载体的实例包括质粒；噬菌粒；粘粒和人工染色体，如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或p1衍生的人工染色体(pac)；噬菌体，如λ噬菌体或m13噬菌体；和动物病毒。用作载体的动物病毒的类别包括逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头状瘤病毒和乳多空病毒(例如sv40)。
18.2)一种抗rbd蛋白的特异性抗体或其抗原结合片段的抗体衍生物，所述抗体衍生物包括前面所述的特异性抗体或其抗原结合片段直接或间接的偶联到可检测标记物形成的复合物。
19.本发明的所述氨基酸序列衍生物是由于一个或多个氨基酸残基的缺失、插入、非保守性或保守性取代或它们的组合而不同于天然氨基酸序列的序列，是具有天然氨基酸序列同样的生物学活性或提高了结构稳定性(如抗热、抗ph等)的衍生物。
20.本发明的所述氨基酸序列衍生物与天然氨基酸序列的序列同一性至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。
21.3)一种经过改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体，所述改造的宿主细胞包括前面所述的特异性抗体或其抗原结合片段，或前面所述的多核苷酸分子或包含其的表达载体。
22.本发明所述的术语“宿主细胞”是指可将包含编码抗体的多核苷酸序列的载体引入进行克隆或基因表达的宿主细胞。适用于克隆或表达本发明载体中的dna的宿主细胞是原核生物、酵母或更高级真核生物细胞。用于此目的的适合原核生物包括真细菌，如革兰氏
阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠内菌科(enterobacteriaceae)，如埃希氏菌属(escherichia)，例如大肠杆菌；肠杆菌属(enterobacter)；欧文氏菌属(erwinia)；克雷伯氏菌属(klebsiella)；变形杆菌属(proteus)；沙门氏菌属(salmonella)，例如鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)；沙雷氏菌属(serratia)，例如粘质沙雷氏菌(serratia marcescans)；和志贺杆菌属(shigella)，以及芽孢杆菌属(bacilli)，如枯草芽孢杆菌(b.subtilis)和地衣芽孢杆菌(b.licheniformis)；假单胞菌属(pseudomonas)，如绿脓杆菌(p.aeruginosa)；和链霉菌属(streptomyces)。
23.4)一种组合物，所述组合物包括前面所述的改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体。
24.进一步，所述组合物包括药学上可接受的辅剂。
25.5)一种检测冠状病毒rbd蛋白的产品，所述产品包括前面所述的特异性抗体或其抗原结合片段、前面所述的多核苷酸分子或包含其的表达载体、或前面所述的抗体衍生物。
26.进一步，所述产品包括试纸、芯片或试剂盒。
27.6)一种检测冠状病毒感染的产品，所述产品包括前面所述的特异性抗体或其抗原结合片段、前面所述的多核苷酸分子或包含其的表达载体、前面所述的抗体衍生物。
28.进一步，所述产品包括试纸、芯片或试剂盒。
29.进一步，所述表达载体包括质粒常规表达载体、慢病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体、piggybac表达载体或sleeping beauty转座表达载体。
30.进一步，所述可检测标记物包括荧光色素如荧光素、罗丹明、texas红、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、多甲藻黄素-叶绿素蛋白，亲和素如生物素、卵白亲和素、链亲和素、卵黄亲和素、类亲和素，顺磁原子，放射性同位素如放射性碘、放射性铯、放射性铱、放射性钴，酶标记物如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶。
31.进一步，所述改造的宿主细胞包括原核细胞如括细菌、放线菌、蓝细菌、支原体、衣原体、立克次氏体，真核细胞如哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母细胞。
32.进一步，所述细菌包括大肠杆菌、枯草杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、假单胞菌属、链霉菌、葡萄球菌。
33.进一步，所述哺乳动物细胞包括成纤维细胞、淋巴细胞、上皮细胞、成髓细胞。
34.进一步，所述哺乳动物细胞包括hek293细胞。
35.本发明提供了一种生产前面所述的特异性抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括如下步骤：
36.a)提供前面所述的多核苷酸分子或包含其的表达载体；
37.b)用步骤a)所述的表达载体转化宿主细胞；
38.c)在适合条件下培养步骤b)所得的宿主细胞；
39.d)从宿主细胞培养液中分离纯化获得前面所述特异性抗体或其抗原结合片段。
40.本发明提供如下任一种方法，所述方法包括：
41.(1)一种非诊断和非治疗目的地检测待测样品中rbd或其片段的方法，所述方法包括如下步骤：将待测样品与前面所述的特异性抗体或其抗原结合片段，或将待测样品与前面所述的抗体衍生物接触，检测rbd或其片段与前面所述的特异性抗体或其抗原结合片段，
或前面所述的抗体衍生物的复合物的形成。
42.(2)一种制备前面所述的改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体的方法，所述方法包括如下步骤：将前面所述的特异性抗体或其抗原结合片段，或前面所述的多核苷酸分子或包含其的表达载体导入到宿主细胞中。
43.(3)一种特异性地抑制rbd的方法，所述方法包括如下步骤：将前面所述的特异性抗体或其抗原结合片段，或前面所述的多核苷酸分子或包含其的表达载体导入到生物体细胞中，通过表达前面所述的特异性抗体或其抗原结合片段抑制rbd的活性。
44.本发明中的术语“rbd”是指冠状病毒s蛋白结构域的细胞受体结合区(receptor binding domain，rbd)。冠状病毒一般包括纤突蛋白(spike，s)、小包膜蛋白(envelope，e)、囊膜蛋白(membrance，m)、核蛋白(nucleocapsid，n)。刺突糖蛋白(s蛋白)与宿主细胞受体结合介导病毒的入侵并决定病毒组织或宿主嗜性。s蛋白可识别宿主细胞受体并介导膜融合，对于病毒颗粒进入细胞至关重要，是病毒感染宿主细胞的关键因子。s蛋白结构域的rbd直接参与了宿主受体的识别，该区域的氨基酸变异会导致病毒的种属嗜性和感染特性的变化。
45.本发明提供了如下任一种应用，所述应用包括：
46.(1)前面所述的特异性抗体或其抗原结合片段、前面所述的多核苷酸分子或包含其的表达载体、前面所述的抗体衍生物，或前面所述的改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体在检测rbd蛋白或其片段中的应用。
47.(2)前面所述的特异性抗体或其抗原结合片段、前面所述的多核苷酸分子或包含其的表达载体、前面所述的抗体衍生物，或前面所述的改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体在制备检测冠状病毒感染的产品中的应用。
48.术语“冠状病毒感染”是指感染冠状病毒，感染的冠状病毒包括2019-ncov、hcov-229e、hcov-oc43、hcov-nl63、hcov-hku1、sars-cov和mers-cov。所述的冠状病毒所引发的症状有发热、干咳、疲劳、咳痰、头痛、咯血和腹泻，严重者会伴随呼吸衰竭、急性呼吸窘迫综合症、休克、器官衰竭等并发症。
49.(3)前面所述的特异性抗体或其抗原结合片段、前面所述的多核苷酸分子或包含其的表达载体、前面所述的改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体在制备诊断冠状病毒相关疾病的药物组合物中的应用。
50.术语“冠状病毒”或“cov”是指冠状病毒家族的任何病毒，包含但不限于sars-cov-2、mers-cov和sars-cov。sars-cov-2是指被鉴定为新出现的冠状病毒。sars-cov-2也被称为2019-ncov。其通过病毒纤突蛋白与人宿主细胞受体血管紧张素转换酶2(ace2)结合。
51.(4)前面所述的特异性抗体或其抗原结合片段、前所述的多核苷酸分子或包含其的表达载体，或前面所述的改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体在制备预防或治疗冠状病毒相关疾病的药物中的应用。
52.(5)前面所述的特异性抗体或其抗原结合片段、前面所述的多核苷酸分子或包含其的表达载体、前面所述的改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体在制备诊断冠状病毒感染的药物组合物中的应用。
53.(6)前面所述的特异性抗体或其抗原结合片段、前面所述的多核苷酸分子或包含其的表达载体，或前面所述的改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体在制备预防或治疗
冠状病毒感染的药物中的应用。
附图说明
54.图1是检测特异性抗体7d9的电泳图；
55.图2是检测特异性抗体7d9的hplc图；
56.图3是elisa检测特异性抗体7d9的结合活性图。
具体实施方式
57.下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。应该理解的是，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。
58.实施例1单克隆抗体的筛选
59.1、重组新冠rbd蛋白的合成
60.合成sars-cov-2病毒的rbd蛋白序列，构建至pem5.1载体；抽提转染用质粒；转染至hek293细胞，培养细胞7天；收获上清，ni柱纯化，经过浓缩置换缓冲液，得到重组新冠rbd蛋白，重组新冠rbd蛋白序列来源uniprot p0dtc2。序列如seq id no：1所示。
61.2、免疫
62.第一次用福氏完全佐剂，每只100μg，腹腔注射，总剂量0.5ml/只，间隔3周进行第二次免疫；第二次起用福氏不完全佐剂，剂量为50μg/0.5ml/只，间隔2周进行第三次免疫；第三次注射后10天准备细胞融合；
63.取饲养细胞，可按105/孔使用，于融合前一天铺板105个/100μl/孔；取小鼠免疫脾细胞与准备好的骨髓瘤细胞用融合剂peg进行融合，铺入已经加入饲养细胞的96细胞培养板，100μl/孔。
64.3、杂交瘤细胞的筛选和克隆
65.通过elisa检测方法进行阳性孔筛选，铺重组表达rbd蛋白过夜；洗板，加脱脂奶粉封闭，37℃，1h；洗板，加入100μl 96孔培养液上清，37℃，孵育1h；洗板，加入hrp标记羊抗鼠二抗，37℃，孵育30min；洗板，加入显色液，显色10min，加入终止液，读取od 450的数值；筛选高表达量细胞株进行亚克隆培养。
66.4、测序
67.收集细胞，采用trizol抽提总rna，用oligo(dt)20为引物，逆转录生成cdna。然后利用特异性引物pcr分别扩增其重、轻链可变区基因。pcr产物经电泳纯化后，通过ta克隆插入载体，进行转化，挑选阳性克隆送测序。
68.5、结果
69.筛选出抗sars-cov-2的单克隆抗体7d9，序列如表1所示。
70.表1单克隆抗体7d9的序列
[0071][0072]
实施例2单克隆抗体7d9的功能性研究
[0073]
1、单克隆抗体的表达和纯化
[0074]
1)对筛选出的序列进行化学合成，并克隆至真核表达载体中。
[0075]
2)对质粒扩增提取。
[0076]
3)将编码抗体的质粒瞬时转染入哺乳动物细胞hek293。
[0077]
4)收集上清，利用亲和层析方法，纯化获得单克隆抗体。
[0078]
5)结果，纯化后的抗体表达量是189mg/l。
[0079]
2、单克隆抗体的理化性质检测
[0080]
2.1凝胶电泳检测单克隆抗体的纯度
[0081]
1)仪器设备如表2所示
[0082]
表2仪器设备
[0083]
名称生产厂家型号化学发光成像仪tanontanon-5200电泳仪bio-radpoweerpacbasic电泳槽bio-raddyc-mini4
[0084]
2)主要试剂如表3所示
[0085]
表3主要试剂
[0086]
名称生产厂家规格货号1mtris-hcl缓冲液北京索莱宝科技有限公司60ml/瓶202009111.5mtris-hcl缓冲液北京索莱宝科技有限公司100ml/瓶2020091110％sds北京索莱宝科技有限公司10ml/瓶20200911faststaingeneuniversal1000ml/瓶21da30％制胶液(29:1)北京索莱宝科技有限公司500ml/瓶20210414彩虹180广谱蛋白marker北京索莱宝科技有限公司250μl(50t)1202f021
[0087]
3)样品制备
[0088]
取20μl的样品与5μl的5
×
还原buffer混合均匀，在95℃中加热5min，冷却；
[0089]
取20μl的样品与5μl的5
×
非还原buffer混合均匀。
[0090]
4)电泳
[0091]
配置胶，加适量的电泳缓冲液，加样，进行电泳。
[0092]
5)染色与脱色
[0093]
电泳结束后，取凝胶放入适量考马斯亮蓝染色液中，室温染色1h或更长时间；倒出染色液，加入适量考马斯亮蓝染色脱色液，室温脱色4-24h。完成脱色后，用ddh2o浸泡，参照marker蛋白，与未染色凝胶对比，切下所需蛋白成分的凝胶，收集起来。然后把所要提纯的蛋白从凝胶中分离出来。
[0094]
6)结果
[0095]
结果如图1所示，从左至右条带分别是marker、还原条带；单克隆抗体的检测纯度均大于95％。
[0096]
2.2hplc检测单克隆抗体的纯度
[0097]
1)仪器设备如表4所示
[0098]
表4仪器设备
[0099][0100]
2)主要试剂如表5所示
[0101]
表5主要试剂
[0102]
名称生产厂家规格货号磷酸氢二钾三水国药集团化学试剂有限公司500g/瓶10017592磷酸二氢钾国药集团化学试剂有限公司500g/瓶10017692氯化钾国药集团化学试剂有限公司500g/瓶10016392
[0103]
3)流动相配制
[0104]
将磷酸氢二钾三水、磷酸二氢钾和氯化钾加入到约900ml纯化水中，搅拌溶解，定
容至1l，用ph计测量，确定其ph在6.2
±
0.1之间。0.22μm滤膜过滤，室温保存。
[0105]
4)样品制备
[0106]
系统适用性样品：mil62标准品用流动相稀释至2mg/ml
[0107]
供试品：待测样品用流动相稀释至2mg/ml。
[0108]
5)色谱条件如表6所示
[0109]
表6色谱条件
[0110][0111]
6)结果
[0112]
结果如图2所示，单克隆抗体的检测纯度均大于95％。
[0113]
3、单克隆抗体的结合活性检测
[0114]
1)包被：用包被液将抗原rbd蛋白稀释成2μg/ml，混匀，加入96孔包被板，100μl/孔，封膜封闭，4℃过夜。
[0115]
2)洗板机洗涤3次，最后一次不能有液体残留在板子上，用吸水纸拍干板子表面的液体。
[0116]
3)封闭：加入5％奶粉(0.5g奶粉溶于10ml dpbs)，300μl/孔，37℃孵育1h，按照步骤2)洗板3次。
[0117]
4)将抗体进行梯度稀释，100μl/孔，37℃反应1h，按照步骤2)洗板3次。
[0118]
5)加二抗：用dpbs按照1:2000稀释，加入96孔板，100μl/孔，37℃反应1h，按照步骤2)洗板3次。
[0119]
6)显色：加入tmb，100μl/孔，室温避光显色10min。
[0120]
7)终止：加入2n h2so4，100μl/孔。
[0121]
8)酶标仪测od 450，10min内检测。
[0122]
9)结果
[0123]
结果如图3所示，单克隆抗体7d9可以与抗原rbd蛋白特异性结合，并且呈现浓度依赖性，ec50为0.03111μg/ml。
[0124]
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。