一种异戊二烯化蛋白GmHIPP26在植物镉转运中的应用

一种异戊二烯化蛋白gmhipp26在植物镉转运中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术技术领域，尤其涉及一种异戊二烯化蛋白gmhipp26在植物镉转运中的应用。


背景技术：

2.重金属污染使作物生产面临着巨大挑战，在cd、ni、hg、as、pb、zn、cr、cu这8种常见土壤重金属元素污染中，镉污染率为25.20％稳居榜首；镉元素在冶金、塑料、电子等各工业行业中均有重要的用途，镉易被吸收、毒性大、污染面积广等被认为是植物生长发育中毒性最强的污染物；此外，镉可通过食物链进入人体，富集在肝和肾中，引起肾损伤、骨痛病、甚至致癌。镉影响植物的抗氧化系统、降低甚至破坏植物的光合系统、破坏植物膜质结构使植物细胞组织液外渗、代谢紊乱，最终导致植物正常生理功能受到损伤，影响植株正常生长发育，导致植株矮小、叶片卷曲和结实率低等问题。
3.因此，在农业生产过程中，如何解决镉污染问题，成为近年来研究的重点。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种异戊二烯化蛋白gmhipp26在植物镉转运中的应用，采用基因编辑技术创制gmhipp26突变体并明确gmhipp26蛋白在重金属镉转运中的功能。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
6.本发明提供了一种异戊二烯化蛋白gmhipp26在植物镉转运中的应用。
7.作为优选，所述植物为大豆。
8.本发明提供了一种异戊二烯化蛋白gmhipp26在植物镉转运中的应用，本发明构建crispr/cas9编辑gmhipp26基因载体，采用大豆农杆菌介导法获得大豆gmhipp26突变体，研究了gmhipp26突变在镉胁迫条件下重金属镉转运中的功能。
附图说明
9.图1为gmhipp26的保守结构域，hma结构域是gmhipp基因家族的保守结构域，根据ncbi网站的搜索结果，gmhipp26有一个hma结构域，证明gmhipp26是典型的hipp基因家族的一员，且其基因功能与重金属相关；
10.图2为栽培大豆gmhipp基因家族进化树分析；
11.图3为gmhipp基因家族在大豆染色体位置分析；
12.图4为50μm cdcl2和cuso4胁迫48小时后gmhipp26在大豆叶片和根中的表达，结果显示，在50μm cuso4和50μm cdcl2胁迫下，gmhipp26基因在大豆根和叶片中相对表达量显著上升且cdcl2胁迫下叶片中gmhipp26基因相对表达量是cuso4胁迫的70余倍；
13.图5为不同浓度cdcl2胁迫对gmhipp26时空表达的影响，其中不同浓度cdcl2胁迫下，叶片gmhipp26相对表达量随不同浓度cdcl2胁迫和胁迫时间的延长而显著上升；在100μm cdcl2胁迫48小时后叶片中gmhipp26表达量达到最大值，为未处理处理的160倍，根中
gmhipp26基因的时空表达量与叶片表达模式相似但表达量表达量远低于叶片，不同浓度镉胁迫处理，gmhipp26基因表达量表现为100μm cdcl2浓度比50μm cdcl2浓度更高，这表明gmhipp26基因可以被重金属诱导表达且其基因表达量与重金属胁迫浓度密切相关；
14.图6为pbgk041载体，pbgk041载体的cas9蛋白经密码子优化，采用大豆u6启动子表达grna序列，并含有bar基因能高效地用于双子叶植物特别是大豆的基因敲除；
15.图7为l3和l4二个gmhipp26突变体测序鉴定；
16.图8为镉胁迫下野生型和gmhipp26突变体大豆表型分析，其中a为正常条件培养；b为25μmcdcl2；c为50μmcdcl2；d为100μmcdcl2；
17.突变体gmhipp26植株及wt植株，在正常水培条件培养下，他们的地上部、地下部、鲜重、干重、株高等无明显差异；而在镉胁迫处理下，wt植株与突变体植株的地上部与地下部鲜重、干重均显著降低，并且wt、l3、l4株高长度随着cdcl2营养液的浓度的升高而降低，其中培养在同一浓度的cdcl2胁迫的突变体植株的干重明显低于wt植株，然而这种降低并未达到显著水平，但是其根冠比有了显著的降低；
18.图9为镉胁迫下crispr/cas9-gmhipp26光合指标与叶绿素分析，其中在正常水培条件培养下，突变体植株的净光合速率、气孔导度、胞间co2浓度与非转基因wt植株之间没有显著性差异；而在镉胁迫处理下，除wt植株的胞间co2浓度少量上升外，突变体植株和wt植株的其他光合作用指标都有显著下降，并且随着cdcl2的浓度增加而随之降低，且与对照组之间有显著性差异；突变体植株的spad值比wt植株更高，且呈显著水平，在低浓度的cdcl2浓度处理下，突变体植株仍然比wt植株的spad值更高；
19.在大田种植后，wt植株与突变体植株的株高，分枝数，底荚高度，荚数等农艺形状上无显著差异，在单株粒数，百粒重，单株产量等产量性状上均无显著差异；
20.图10为镉胁迫下crispr/cas9-gmhipp26大豆镉富集含量分析，其中每克大豆根部组织(鲜重)中的cd
2+
富集量最高达到576μg，每克大豆叶片组织(鲜重)的cd
2+
富集量最高达到5.66μg；在cdcl2胁迫后，在wt植株与突变体比较中发现，突变体植株每克根部和叶片均比wt植株富集了更多的cd
2+
，cd
2+
含量差距已经达到了极显著水平。
具体实施方式
21.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
22.实施例1gmhipp26生物信息学及组织特异性表达分析
23.ncbi网站的搜索表明gmhipp26(ncbi编号：loc100780624)有一个hma结构域，是典型的hipp基因家族的一员，详见图1。hma结构域与根系重金属向木质部装载金属离子过程中起主要作用。大豆基因组中共有32个hipp基因，根据mega6.0软件制作的进化树结果可以看出gmhipp26亲缘关系相近的是gmhipp25和gmhipp5。利用大豆gmhipp基因序列进行比对并通过软件mega6.0构建了nj系统发生树，揭示了大豆gmhipp基因之间的进化关系(图2)。在大豆蛋白质可视化图谱中，相同的大豆蛋白质序列可视为一个motif模块，此次实验共人为划定10个不同的模块，根据模块的分布情况可以检验gmhipp蛋白家族的保守情况。结果显示，gmhipp蛋白家族相对保守，模块分布大体一致，证明gmhipp蛋白在大豆基因组中是一类非常保守的蛋白家族，其蛋白质序列高度相似。mega6.0软件和tbtools软件分析后得出
hipp基因是一类非常保守的基因家族，其保守结构域位置和内含子、外显子的分布也高度相似。文献指出羧基端氨基酸性基序为caax(a＝i、v、l、a、s、t和x＝i、l、m、q、s或a)，此结构对于蛋白质发挥生物学功能，如蛋白质与膜互作、蛋白质之间的相互作用十分重要。gmhipp基因家族在染色体的位置结果显示，在20号染色体上gmhipp基因最多，有5个，且基因位置比较相近。在第4、5、11、13、14、18号染色体上分别有一个gmhipp基因。其中，gmhipp26基因在第12号染色体上，详见图3。
24.实施例2重金属胁迫处理对gmhipp26时空表达的影响
25.在50μm cuso4和50μm cdcl2胁迫下，gmhipp26基因在大豆根和叶片中相对表达量显著上升且cdcl2胁迫下叶片中gmhipp26基因相对表达量是cuso4胁迫的70余倍(图4)。不同浓度cdcl2胁迫下，叶片gmhipp26相对表达量随不同浓度cdcl2胁迫和胁迫时间的延长而显著上升(图5)。在100μm cdcl2胁迫48小时后叶片中gmhipp26表达量达到最大值，为未处理处理的160倍。根中gmhipp26基因的时空表达量与叶片表达模式相似但表达量远低于叶片。不同浓度镉胁迫处理，gmhipp26基因表达量表现为100μm cdcl2浓度比50μm cdcl2浓度更高。这表明gmhipp26基因可以被重金属诱导表达且其基因表达量与重金属胁迫浓度密切相关。
26.实施例3gmhipp26基因编辑载体的构建、根癌农杆菌介导转化及基因编辑幼苗的鉴定
27.采用pcr方法扩增bar基因，所用的bar引物(f:cgagtcgaccgtgtacgtc；r:gcaactgtcggtccaatagac)，扩增条件为94℃预变性2分钟，94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，32个循环，72℃延伸5分钟，扩增的pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，特异性目的条带进行回收并测序，验证为bar序列的目的条带用于载体的构建。
28.以pbgk041作为编辑载体的基础载体(图6)，该载体的cas9蛋白经密码子优化，采用大豆u6启动子表达grna序列，同时含有bar基因能高效地用于大豆的基因敲除筛选。采用冻融法将载体质粒转入根癌农杆菌中用于大豆转化。
29.以发芽1天的天隆一号大豆子叶作为外植体进行根癌农杆菌转化，以草丁膦作为筛选标记，通过外植体分离、农杆菌侵染、农杆菌共培养、芽诱导、芽伸长、根诱导，得到幼苗；采用叶片涂抹法、pcr反应、bar试纸条，基因片段测序的方式鉴定转基因阳性苗；通过gmhipp26基因测序验证明确为基因编辑的幼苗经过后代分离为纯合体l3、l4的用于大豆重金属胁迫的鉴定(图7)。
30.实施例4突变体幼苗大豆重金属cdcl2胁迫的鉴定
31.选取两个独立基因编辑的突变体幼苗株系，对照为天隆一号非转基因幼苗，在重金属胁迫处理前，保证这三种株系长势相同。在0μm，25μm，50μm，100μm的cdcl2梯度营养液中，连续培养一周，三个株系均出现一定程度的改变(图8a，图8b，图8c和图8d)，wt植株与突变体植株的地上部与地下部鲜重、干重、株高均显著降低，并且wt、l3、l4株高长度随着cdcl2营养液的浓度的升高而降低(表1)。其中培养在同一浓度的含有cdcl2的营养液的突变体植株的干重明显低于wt植株，然而这种降低并未达到显著水平，但是其根冠比有了显著的降低，这说明cdcl2营养液对植株的影响主要体现在对根部的干重影响。
32.表1
[0033][0034][0035]
在正常水培条件培养下，突变体植株的净光合速率、气孔导度、胞间co2浓度与非转基因wt植株之间没有显著性差异。而在镉胁迫处理下，除wt植株的胞间co2浓度少量上升外，突变体植株和wt植株的其他光合作用指标都有显著下降，并且随着cdcl2的浓度增加而随之降低，且与对照组之间有显著性差异。这证明重金属胁迫严重影响植物光合作用，推测是由于聚集在植物体内的重金属，紊乱了光合系统，使其无法正常进行光合作用。突变体植株与wt植株相比，其净光合速率、气孔导度、胞间co2浓度均显著降低，因为突变体植株的gmhipp26基因被编辑，所以应对重金属胁迫时比正常植株的光合作用表现的更差(图9a，b，c)。
[0036]
其spad值的结果表明，在正常水培条件培养下，突变体植株的spad值比wt植株更高，且呈显著水平，在低浓度的cdcl2浓度处理下，突变体植株仍然比wt植株的spad值更高，但随着cdcl2的处理浓度增加，突变体植株与wt植株的spad值差距在不断减少，直至在100μm cdcl2胁迫处理时，突变体植株与wt植株的spad值已经没有显著性差异。根据这一趋势可以得出，随着重金属胁迫处理浓度的升高，两类大豆的spad值呈先升高后降低的态势，且突变体植株与wt植株都在25μm cdcl2胁迫处理下达到最大值，wt植株的spad值变化整体平稳而突变体植株的spad值则整体降低(图9d)。
[0037]
根据电感耦合等离子体质谱仪的测定结果，发现大豆根部和叶片的镉离子富集量差异很大。每克大豆根部组织(鲜重)中的cd
2+
富集量最高达到576μg，每克大豆叶片组织(鲜重)的cd
2+
富集量最高达到5.66μg，差距达上百倍。在cdcl2胁迫后，在wt植株与突变体比较中发现，突变体植株每克根部和叶片均比wt植株富集了更多的cd
2+
，cd
2+
含量差距已经达到了极显著水平，详见图10a和10b。wt植株与突变体植株的根部富集镉离子含量有显著性差异，而叶片中突变体植株与wt植株的镉离子富集量却在2～8g不等，含量差异并不明显(图10)。
[0038]
实施例5突变体植株农艺性状
[0039]
结果表明，在大田种植后，突变体植株与野生型植株在株高，分枝数，底荚高度，荚数等农艺形状上无显著差异，在单株粒数，百粒重，单株产量等产量性状上均无显著差异。
这表明编辑了gmhipp26基因的突变体与wt植株在正常大田种植情况下无显著性差异，gmhipp26基因在正常环境下对植株的作用和影响较小(表2)。
[0040]
表2
[0041]
基因型wtgmhipp26-l3gmhipp26-l4株高(cm)46.94
±
6.49
ab
49.43
±
3.32a50.13
±
4.56a分枝数2.1
±
0.45a2.0
±
1.52a1.5
±
0.71a底荚高度(cm)7.8
±
1.3a8.38
±
1.5a7.25
±
0.2a荚数30.1
±
2.95
ab
32.33
±
9.22a28.5
±
4.95a单株粒数55.8
±
8.56a50
±
12.73a56.2
±
10.71a百粒重(g)16.6
±
2.4
ab
15.54
±
2.2
ab
17.19
±
1.08a单株产量(g/株)6.64
±
1.04a5.89
±
0.68a6.23
±
0.68a[0042]
由以上实施例可知，本发明提供了一种异戊二烯化蛋白gmhipp26在植物镉转运中的应用，本发明构建crispr/cas9编辑gmhipp26基因载体，采用大豆农杆菌介导法获得大豆gmhipp26突变体，研究了gmhipp26突变在镉胁迫条件下重金属镉转运中的功能。
[0043]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。