一种合成与分泌高效电子传递载体吩嗪-1-羧酸的重组希瓦氏菌株构建方法及用途

1.本发明属于生物能源技术领域，具体涉及一种高效合成与分泌电子传递载体的重组希瓦氏菌株构建方法及用途。


背景技术：

2.能源短缺和环境污染是现今面临的日益严峻的问题。科学家们不断寻找新的技术解决方案，其中微生物燃料电池(microbial fuel cell,mfc)就是其中之一用来产生可替代能源和环境废物治理新装置，并且其重要性现今日益显现。
3.mfc是利用产电微生物作为阳极催化剂将有机物中的化学能转化为电能的装置。微生物产电能力相差很大，产电微生物决定着mfc的功能及应用，希瓦氏菌(shewanella oneidensis)属是目前发现的广泛用于mfc中产电的微生物之一，其代谢路径和胞外电子传递路径研究的比较明确。shewanella oneidensis mr-1(简称希瓦氏菌mr-1)是希瓦氏菌属中在基因组序列注释和遗传特性方面研究最广泛的菌株。希瓦氏菌mr-1已经被证实，能够利用核黄素等黄素类化合物、吩嗪-1-羧酸等吩嗪类化合物以及腐殖酸等富含蒽醌类物质作为电子传递载体，介导其胞外电子传递。然而，野生希瓦氏菌电子传递载体合成能力有限，并且细胞通透性差，胞内合成的电子传递载体无法快速传递至胞外，因此严重限制了其胞外电子传递速率。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种电子传递载体吩嗪-1-羧酸高效合成与分泌的希瓦氏菌株。
5.本发明的第二个目的是提供一种高效合成与分泌电子传递载体的重组希瓦氏菌株的构建方法。
6.本发明的第三个目的是提供一种高效合成与分泌电子传递载体的重组希瓦氏菌株在产电中的作用。
7.本发明的第四个目的是提供一种高效合成与分泌电子传递载体的重组希瓦氏菌株在促进细胞膜通透性上的应用。
8.本发明的第五个目的是提供一种高效合成与分泌电子传递载体的重组希瓦氏菌株在电子载体吩嗪-1-羧酸合成上的应用。
9.方案概括如下：
10.一种高效合成与分泌电子传递载体的重组希瓦氏菌株的构建方法，包括如下步骤：从pseudomonas aeruginosa pao1的基因组上pcr获得假单胞菌的外膜孔蛋白基因oprf和控制分泌吩嗪-1-羧酸(pca)分泌的基因簇phzabcdefg，在希瓦氏菌中同时异源表达得到高效电子生成与传递的重组希瓦氏菌株sp1。
11.有益效果：研究表明微生物胞外电子传递(extracellular electron transfer,
eet)是一个受多种细胞成分影响的复杂过程。而电子传递载体能够介导“胞内-胞外”电子传递，一定程度决定了细胞与电极之间的电子传递速率。pca作为一种高效电子载体，与mr-1自身分泌的核黄素相比，pca介导的电子传递效率更高。pca在胞内合成后，通过孔蛋白oprf分泌到胞外，与外膜细胞色素mtrc结和omca结合。氧化态的pca外膜细胞色素辅因子结合接受一个电子，变成还原态pca，还原态pca携带电子扩散到阳极电极表面释放电子后变成氧化态pca，氧化态的pca又扩散回细胞外膜表面重新接受电子，如此循环往复在细胞和电极之间传递电子。因此，构建一种高效合成与分泌电子传递载体的重组希瓦氏菌株，异源表达pca合成的核心基因簇和细胞孔蛋白oprf，使希瓦氏菌在合成电子传递载体pca的同时，表达孔蛋白，增强细胞通透性，加速细胞分泌电子传递载体pca到胞外，因此极大地提高了基于“电子传递载体介导”胞外电子传递速率，同时提高mfc的电化学性能。本发明构建的一种高效合成与分泌电子传递载体的重组希瓦氏菌株sp1为双质粒异源表达菌株，该菌株能够在胞内生成pca，外膜孔蛋白oprf的表达促进了pca的外排，进而增强胞外电子传递，提高微生物燃料电池的功率密度。
附图说明
12.图1为phg13-oprf质粒图谱；
13.图2为pyydt-phzabcdefg质粒图谱；
14.图3为高效合成与分泌电子传递载体的重组希瓦氏菌株sp1的电功率密度曲线；
15.图4为高效合成与分泌电子传递载体的重组希瓦氏菌株sp1的细胞通透性测定。
16.图5为pca在hplc的浓度标准曲线。
17.图6为高效合成与分泌电子传递载体的重组希瓦氏菌株sp1发酵液hplc谱图。
具体实施方式
18.下面结合实施例对本发明提供的一种高效合成与分泌电子传递载体的重组希瓦氏菌株构建方法及用途进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
19.原始菌株野生型希瓦氏菌shewanella oneidensis mr-1简称：野生型希瓦氏菌mr-1，于2010年9月购自atcc(美国，https://www.atcc.org/)公司的atcc 700550菌株。
20.下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
21.实施例1
22.一种高效合成与分泌电子传递载体的重组希瓦氏菌株的构建方法，包括如下步骤：从pseudomonas aeruginosa pao1的基因组上扩增外源基因oprf与phzabcdefg。其中oprf基因选择lacuv5启动子，并连接到phg13载体；phzabcdefg基因簇选择tac启动子，并连接到pyydt载体。然后将构建完成的质粒导入野生型希瓦氏菌，得到重组希瓦氏菌株sp1，所述基因oprf与基因簇phzabcdefg的核苷酸序列如seq id no.7和seq id no.9所示，启动子lacuv5及其rbs序列如seq id no.11所示，启动子tac及其rbs序列如seq id no.12所示。
23.具体构建方法包括如下步骤：
24.1.基因oprf与的扩增
25.体系：
[0026][0027]
程序：
[0028][0029]
2.基因簇phzabcdefg的扩增
[0030]
体系：
[0031][0032]
程序：
[0033][0034][0035]
3.表达载体的构建：
[0036]
以phg13质粒(seq id no.5)为模板，以phg13-f(seq id no.13)和phg13-r(seq id no.14)为引物，进行pcr扩增线性化载体。最后将线性化载体片段phg13和外膜孔蛋白oprf的基因(seq id no.7)进行连接得到载体phg13-oprf(seq id no.8)。测序检测无误。最终的质粒图谱如图1所示。
[0037]
以pyydt质粒(seq id no.6)为模板，以pyydt-f(seq id no.15)和pyydt-r(seq id no.16)为引物，进行pcr扩增线性化载体。最后将线性化载体片段pyydt和合成pca的基因簇phzabcdefg(seq id no.9)进行连接得到载体pyydt-phzabcdefg(seq id no.10)。测
序检测无误。最终的质粒图谱如图2所示。
[0038]
将构建好的质粒pyydt-phzabcdefg先转入大肠杆菌wm3064(商业菌株)中，然后与希瓦氏菌mr-1结合转移，将构建好的质粒转入希瓦氏菌mr-1中，待长出单菌落后进行菌落pcr验证获得重组希瓦氏菌株so3；
[0039]
将构建好的质粒phg13-oprf先转入大肠杆菌wm3064(商业菌株)中，然后再与上述构建完成的希瓦氏菌so3结合转移，获得具有双质粒的目的菌株sp1。
[0040]
希瓦氏菌mr-1需要在lb培养基中，30℃培养，而大肠杆菌wm3064的生长需要在lb培养基中添加0.3m/ml dap(2,6-二氨基庚二酸)，37℃培养，培养菌株时在培养基中添加相应的抗性。
[0041]
e.coli wm3064化学转化步骤：
[0042]
1.从-80℃冰箱中取50ul wm3064感受态细胞置于冰上10min；
[0043]
2.分别把构建好的质粒phg13-oprf和质粒pyydt-phzabcdefg与wm3064感受态细胞在1.5ml的离心管中混匀，冰浴30min；
[0044]
3.然后在水浴锅中42℃热激90s，再次冰浴5min；
[0045]
4.向上述体系中添加1ml含0.3m/ml dap的lb培养基，37℃，200rpm，培养1小时；
[0046]
5.取200ul培养液分别涂布于含有100mg/l氯霉素抗性(质粒phg13-oprf)和50mg/l卡那霉素抗性(质粒pyydt-phzabcdefg)的lb平板上，37℃培养12小时；
[0047]
6.挑取单菌落进行pcr验证，条带正确的菌株提质粒后进行测序验证。
[0048]
验证正确的wm3064菌株过夜培养后与希瓦氏菌mr-1进行接合转移。
[0049]
单质粒希瓦氏菌株so3的结合转移步骤如下：
[0050]
1.将含有质粒pyydt-phzabcdefg的e.coli wm3064甘油菌和s.oneidensis mr-1甘油菌从-80℃冰箱中取出，吸取适量接种至相应抗性的培养基中，在相应温度及转速的摇床中过夜培养(e.coli wm3064，37℃,220rpm；s.oneidensis mr-1，30℃，200rpm)；
[0051]
2.吸取含质粒pyydt-phzabcdefg的e.coli wm3064和s.oneidensis mr-1各500μl至ep管中，混匀，5000rpm离心10min，倒掉上清，用lb+100μg/ml 2,6-二氨基庚二酸(dap)液体培养基重新悬浮，30℃恒温培养箱中静置2h；
[0052]
3.吸取100μl上述混合菌液均匀涂布到含有50mg/l卡那霉素抗性的lb(不含dap，抑制e.coli wm3064生长)固体培养基上，置于30℃的恒温培养箱中过夜培养；
[0053]
4.菌落pcr筛选正确的转化子，进行测序验证，进行下一步实验。
[0054]
双质粒希瓦氏菌株sp1的结合转移：
[0055]
1.将含有质粒phg13-oprf的e.coli wm3064甘油菌和含有pyydt-phzabcdefg质粒的so3甘油菌从-80℃冰箱中取出，吸取适量接种至相应抗性的培养基中，在相应温度及转速的摇床中过夜培养(e.coli wm3064，37℃,220rpm；s.oneidensis mr-1，30℃，200rpm)；
[0056]
2.吸取含质粒phg13-oprf的e.coli wm3064和含有pyydt-phzabcdefg质粒的so3各500μl至ep管中，混匀，5000rpm离心10min，倒掉上清，用lb+100μg/ml 2,6-二氨基庚二酸(dap)液体培养基重新悬浮，30℃恒温培养箱中静置2h；
[0057]
3.吸取100μl上述混合菌液均匀涂布到含有100mg/l氯霉素抗性和50mg/l卡那霉素抗性的lb(不含dap，抑制e.coli wm3064生长)固体培养基上，置于30℃的恒温培养箱中过夜培养；
[0058]
4.菌落pcr筛选正确的转化子，进行测序验证，进行下一步实验。
[0059]
实施例2：产电重组希瓦氏菌株sp1、重组希瓦氏菌株so3和野生型希瓦氏菌mr-1mfc产电性能表征
[0060]
1、菌株活化
[0061]
将高效电子传递载体合成与分泌的重组希瓦氏菌株sp1、重组希瓦氏菌株so3和野生型希瓦氏菌mr-1从-80℃冰箱取出，在100mg/l氯霉素抗性和50mg/l卡那霉素抗性的lb、50mg/l卡那霉素抗性的lb和无抗性lb培养基里30℃，200rpm，分别过夜培养。
[0062]
将过夜培养结束的菌液按1％的比例接种入含有0.5mm iptg的具有100mg/l氯霉素抗性和50mg/l卡那霉素抗性以及无抗的阳极液中，30℃，200rpm，培养10小时，测od
600
，计算体积(mfc中od
600
＝0.7)，补加阳极液至od
600
＝0.7，加入mfc阳极室中。
[0063]
阳极液包含6g/l磷酸氢二钠、3g/l磷酸二氢钾、0.5g/l氯化钠、1g/l氯化铵、1mm硫酸镁、0.1mm氯化钙、20mm乳酸钠、5％lb培养基，余量是水。
[0064]
2、mfc产电性能表征
[0065]
实验装置采用双室mfc,110ml阳极室(包含菌体和阳极液共110ml)和110ml阴极室，阳极碳布电极大小为1cm
×
1cm，阴极碳布电极大小为2.5cm
×
3cm，双室之间用质子交换膜隔开，质子交换膜用之前用1m盐酸水溶液过夜浸泡，并用无菌的蒸馏水冲洗三次。
[0066]
阴极液包含50mm铁氰化钾、50mm磷酸氢二钾和50mm磷酸二氢钾，余量是水。mfc放在30℃培养箱中，阴阳两极连接2kω的外电阻。
[0067]
3、电化学性能分析
[0068]
线性扫描伏安法(lsv)从-0.87v扫到-0.1v，扫速为0.1mv/s，仪器为多通道电化学工作站chi1000c。
[0069]
4、结果
[0070]
利用生物电化学分析可以研究mfc中胞外电子传递效率，图3所示是以扫速为0.1mv/s的线性扫描伏安图(lsv)即极化曲线，从图上可以看出，利用产电重组希瓦氏菌sp1进行mfc发电的最大电流密度约为6584ma/m2，最大功率密度为2252.9mw/m2，相对于原始菌株野生型希瓦氏菌mr-1和重组希瓦氏菌株so3得到大幅提升。
[0071]
实施例3：产电重组希瓦氏菌株sp1和未表达孔蛋白的重组希瓦氏菌so3细胞膜通透性表征
[0072]
1、菌株活化
[0073]
将高效电子传递载体合成与分泌的重组希瓦氏菌株sp1和重组希瓦氏菌so3从-80℃冰箱取出，在100mg/l氯霉素抗性和50mg/l卡那霉素抗性的lb和50mg/l卡那霉素抗性lb培养基里30℃，200rpm，分别过夜培养。
[0074]
2、npn荧光测定
[0075]
培养10h后的重组希瓦氏菌株sp1和野生型希瓦氏菌mr-1用10mm pbs缓冲液(ph＝7.4)清洗三次，1ml菌液加入适量npn(1-n-phenylnaphylamine，6μm)，孵育10min，取200μl菌液加入透明96孔板中，置入酶标仪中，在355nm激发波长下，测400-500nm荧光值。
[0076]
3、结果
[0077]
非极性荧光探针1-n-苯基萘胺(npn)是一种成熟的细胞膜透过性测定的荧光探针，利用npn可以量化分子向细胞内转运的效率。它在磷脂的环境中荧光性很强，而在水环
境中荧光能力较弱，npn可以进入细胞膜的磷脂层，从而产生明显的荧光。如图4所示，细胞悬液中增加npn后，在355nm激发波长下，工程改造后的希瓦氏菌sp1在415nm处有较强的吸收光，是未表达孔蛋白的重组希瓦氏菌so3约2倍，这表明重组希瓦氏菌sp1的细胞膜透过性增加。
[0078]
实施例4：产电重组希瓦氏菌株sp1的电子传递载体pca发酵产量测定
[0079]
1、菌株活化
[0080]
将高效电子传递载体合成与分泌的重组希瓦氏菌株sp1从-80℃冰箱取出，在100mg/l氯霉素抗性和50mg/l卡那霉素抗性的lb培养基里30℃，200rpm，过夜培养。
[0081]
2、扩大培养
[0082]
将过夜培养结束的菌液按1％的比例接种入含有0.5mm iptg的具有100mg/l氯霉素抗性和50mg/l卡那霉素抗性的阳极液中，30℃，200rpm，培养10小时。
[0083]
阳极液包含6g/l磷酸氢二钠、3g/l磷酸二氢钾、0.5g/l氯化钠、1g/l氯化铵、1mm硫酸镁、0.1mm氯化钙、20mm乳酸钠、5％lb培养基，余量是水。
[0084]
3、样品处理
[0085]
取270μl扩大培养的发酵液，加入30μl的6m盐酸,震荡10秒,混合均匀后加入270μl的乙酸乙酯,震荡2分钟,然后12000rpm离心10分钟,取乙酸乙酯相100μl至一个新的1.5ml离心管中,离心浓缩蒸干。离心浓缩蒸干后将样品重新溶解在300μl甲醇中,待充分溶解后,13000rpm离心10分钟去除杂质,取100μl上层溶液，过膜，作为hplc的样品。
[0086]
5、hplc测定
[0087]
仪器型号:岛津hplc；分析柱:hypersil
tm
bds c18 5um,4.6x150 mm；流动相:40％a:5mm醋酸铵60％b:甲醇；进样量:2u1；柱温:30℃；紫外检测波长:254nm；流速:0.7ml/min。
[0088]
6、结果
[0089]
pca的保留时间为2.87，pca标准曲线(图5)为y＝11770x-1704.9(y为峰面积，x为样品pca浓度μm，r2＝0.9998)，基于样品制备过程可得发酵液浓度(μm)＝样品pca浓度*300/100。样品在2.87的保留时间所测得的峰面积为325391(图6)，算得其发酵液pca浓度为82.5μm。
[0090]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。