一种乳源外泌体的制备方法与流程

1.本发明涉及一种外泌体的制备方法，具体涉及一种从乳液中分离获得外泌体的方法。


背景技术：

2.细胞外囊泡（extracellular vehicles，evs）是一种由包括真核生物、原核生物在内的大多数细胞分泌的具有膜结构的微小膜泡，根据大小和来源，主要分为外泌体、微囊泡(mvs)或微颗粒(mps)和凋亡小体。外泌体是由多泡体(mvbs)与质膜融合而成的囊泡，mvs由质膜直接向外出芽形成，凋亡小体由细胞凋亡后释放。在过去的几十年里，evs的生物学作用已被广泛报道。evs是一种纳米级囊泡，它可通过膜融合、受体-配体相互作用、细胞内吞或吞噬等多种机制，将携带的生物活性分子从供体细胞转移到受体细胞，因此可作为细胞间信息交流的载体，用于传递蛋白质、脂类、核酸以及代谢分子，对下游的接收细胞起到效应刺激和调节的作用。与传统的纳米材料相比，evs具有生物相容性、生物可降解性、低毒性和非免疫原性等优点，是纳米医学中最有前景的候选者之一。
3.在纳米医学中，大多数研究集中于外泌体和mvs/mps，对凋亡小体的研究较少。随着人们对细胞外囊泡研究的开展，从血浆、唾液、尿液、脑脊液和乳液等多种体液中分离的天然外泌体的功能被逐渐发现，为天然外泌体在疾病诊断和临床应用的价值的挖掘奠定了物质基础。然而外泌体的工业化提取和纯化往往需要通过昂贵的大规模细胞培养来获得更大量的上游原料，降低上游成本是外泌体制药行业面临的最大问题。相比血浆等其他来源的外泌体，乳液来源的外泌体（简称乳源外泌体），例如牛奶外泌体，具有更低的免疫原性、更高的生物兼容性、以及天然的靶向能力和良好的生物屏障渗透性等优点，同时乳源外泌体还具有来源广泛，原料成本低的优势，可成为天然药物和纳米药物的优选载体。还有文献研究报道牛奶来源的外泌体可以在胃中的强酸环境中存活，牛奶外泌体将会成为一种最具前景的口服给药载体系统。
4.外泌体的提取技术主要包括超速离心法、密度梯度离心法、化学沉淀法、尺寸排阻法、免疫捕获法等。超速离心根据样品中外泌体、蛋白质、细胞碎片、细胞以及细胞器等物质沉降速度的差异，通过不同的离心力和离心时间，将外泌体上清液分离；密度梯度离心法利用外泌体与其他溶质的密度差异而实现分离；化学沉淀法通过聚乙二醇（peg）等，改变外泌体溶解度和分散性，使溶解性较低的组分从溶液中析出；尺寸排阻法是根据外泌体大小利用色谱柱进行分离提取的方法，可以获得较为完整的外泌体。乳液富含大量的游离蛋白质和脂肪，极易干扰外泌体的提取和纯化，上述方法为通用方法，用于乳源外泌体提取及纯化时无法同时兼顾乳源外泌体的质量和收率。保证纯度，则收率无法提高，相应地，外泌体的生产成本和使用成本高，生产效率低；保证收率，则外泌体的纯度、膜结构的完整性等质量下降，相应地，会干扰下游对乳源外泌体天然生物活性的测试，并影响基于乳源外泌体的药物递送系统的开发。
5.专利cn111012924 a公开了一种牛奶外泌体的制备方法，其通过离心得到脱脂奶、
调酸去除酪蛋白、离心和微滤组合使用得到牛奶外泌体，该方法制备牛奶外泌体易出现损伤，且纯度不理想。
6.专利cn109468265 b公开了一种提取牛乳外泌体的方法，其通过离心去除乳脂层、上清液调酸并使用凝乳酶去除酪蛋白、微滤收集牛乳外泌体，该方法的产率和纯度不佳，且同样会存在牛乳外泌体损伤。
7.专利cn113061571 a公开了一种荷斯坦牛乳外泌体分离及鉴定的方法，其通过离心去除乳蛋白、密度梯度离心等手段的组合进行牛乳外泌体纯化，该方法虽然可以获得较好的纯度，但是操作非常繁琐，同时，外泌体的收率较低。
8.纵观现有技术，始终缺乏可兼顾外泌体质量和收率的乳源外泌体的制备方法。提供能够兼顾外泌体质量和收率的方法，仍是乳源外泌体药用价值挖掘和基于乳源外泌体的药物递送开发首要解决的问题。


技术实现要素：

9.本发明所解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种改进的乳源外泌体的制备方法。
10.为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：一种乳源外泌体的制备方法，以乳液为原料，包括以下工序：（1）去除乳液中的脂肪和乳蛋白，得到ph值为4~6的酸性乳清；（2）将所述的酸性乳清浓缩，得到酸性浓缩乳清；（3）使用碱性物质调节所述的酸性浓缩乳清的ph值至6.5~7.5，得到中性乳清；（4）对所述的中性乳清进行分离纯化，得到所述的乳源外泌体。
11.根据本发明的进一步优选实施方案，在所述工序（3）中，使用碱性物质调节酸性浓缩乳清的ph值至6.8~7.2。在一些特别优选且具体实施方式中，控制调节后的ph值为7.0。
12.进一步地，工序（3）中，为了调节ph的目的，所述的碱性物质的选择不受限制，但作为本发明的优选实施方案，碱性物质优选是选自氢氧化钠、磷酸氢二钠、磷酸氢钠中的一种或多种的组合。在根据本发明的一些具体优选实施方式中，所述的碱性物质采用浓度为4mol/l~6mol/l的naoh水溶液。例如浓度为4mol/l的naoh水溶液、浓度为4.5mol/l的naoh水溶液、浓度为5mol/l的naoh水溶液、浓度为5.5mol/l的naoh水溶液或浓度为6mol/l的naoh水溶液等。
13.根据本发明的优选实施方案，工序（2）中，采用切向流超滤进行浓缩。进一步优选地，所述的切向流超滤采用截留分子量为100kda~500kda的中空纤维柱。根据本发明的进一步优选实施方案，中空纤维柱的截留分子量为100kda~200kda，例如截留分子量为100kda的中空纤维柱、截留分子量为120kda的中空纤维柱、截留分子量为150kda的中空纤维柱、截留分子量为180kda的中空纤维柱、截留分子量为200kda的中空纤维柱等。
14.优选地，工序（2）中，所述的浓缩的倍数为5~10倍，例如5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、10倍等。
15.根据本发明的更进一步优选实施方案，工序（2）中，在采用切向流超滤前，先采用微滤膜对所述的酸性浓缩乳清进行微滤。进一步优选地，所述的微滤包括对酸性乳清进行多级微滤，该多级微滤所采用的滤膜的孔径依次减小。
16.以采用三级微滤为例进行说明，先对酸性乳清进行第一级微滤得到初级截留液，之后对所述的初级截留液进行第二级微滤得到二级截留液，最后对二级截留液进行第三级微滤得到用于浓缩的滤液，其中，第一级微滤采用的滤膜的孔径＞所述的第二级微滤采用的滤膜的孔径＞所述的第三级微滤的滤膜的孔径。
17.在根据本发明的一些具体且优选实施方式中，所述的多级微滤为三级微滤，其中第一级微滤采用的滤膜的孔径为0.5μm~0.8μm，第二级微滤采用的滤膜的孔径为0.3μm~0.5μm，第三级微滤采用的滤膜的孔径为0.2μm~0.25μm。
18.根据本发明的进一步优选方案，工序（1）中，所述的酸性乳清的ph值为4.3~4.8，例如4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8。
19.优选地，工序（1）中，先去除乳液中的脂肪获得乳清，之后使用酸性物质调节乳清的ph值使乳蛋白析出，最后去除析出的乳蛋白，得到酸性乳清，这其中：采用的酸性物质没有特别限制，例如可以为盐酸、冰醋酸、柠檬酸、磷酸中的一种或多种的组合。在一些具体且优选实施方式中，工序（1）中，所述的酸性物质为浓度为5mol/l~7mol/l的盐酸水溶液。例如浓度为5mol/l的盐酸水溶液、浓度为5.5mol/l的盐酸水溶液、浓度为6mol/l的盐酸水溶液、浓度为6.5mol/l的盐酸水溶液、浓度为7mol/l的盐酸水溶液等。
20.优选分别采用离心法去除所述的乳液中的脂肪和析出的乳蛋白。再进一步优选地，所述的离心法采用的离心力为1500g~6500g。还进一步优选地，将乳液在第一离心力下进行第一级离心，第一级离心所得乳清在第二离心力下进行第二级离心，使用酸性物质调节第二级离心所得的乳清的ph值，然后在第三离心力下进行第三级离心得到所述的酸性乳清，所述的第一离心力和所述的第三离心力大于所述的第二离心力。再进一步优选地，所述的第一离心力为5000g~7000g，所述的第二离心力为1500g~2500g，所述的第三离心力为4500g~6500g。更进一步优选地，所述的第一级离心和/或所述的第二级离心的时间为5 min ~30min，所述的第三级离心的时间为20 min ~40min。
21.优选地，工序（4）中，所述的中性乳清先依次经分子排阻色谱法、密度梯度离心得到外泌体梯度层，然后对所述的外泌体梯度层进行离心得到沉淀物，所述的沉淀物即为所述的乳源外泌体。
22.进一步优选地，所述的分子排阻色谱法采用排阻分子量为650kda~750kda的分子排阻色谱柱。例如排阻分子量为650kda的分子排阻色谱柱、排阻分子量为680kda的分子排阻色谱柱、排阻分子量为700kda的分子排阻色谱柱、排阻分子量为720kda的分子排阻色谱柱、排阻分子量为740kda的分子排阻色谱柱。
23.进一步优选地，所述的密度梯度离心采用不连续密度梯度的分层液，其中：所述的分层液可以为碘克沙醇溶液或葡萄糖溶液。优选地，所述的分层液的质量分数范围为5%~50%。更进一步优选地，所述的分层液的质量分数自下向上按照5%~15%的梯度递减。
24.所述的密度梯度离心的离心力优选为100000g~200000g。更进一步优选地，所述的密度梯度离心的离心时间为5h~20h，例如5h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h等。
25.所述的分层液的表面优选使用pbs缓冲液、tris缓冲液或hepes缓冲液进行封层。
26.工序（4）中，进一步优选地，在离心力为100000g~120000g的条件下对所述的外泌
体梯度层进行离心得到所述的沉淀物。更进一步优选地，对所述的外泌体梯度层进行离心的时间为1h~2h。进一步优选地，所述的沉淀物使用pbs缓冲液、tris缓冲液、hepes缓冲液或无菌无酶水重悬后保存。
27.本发明还提供一种乳源外泌体的制备方法，以乳液为原料，包括以下步骤：（1）采用离心去除乳液中的脂肪得到乳清；（2）采用酸性物质调节所述的乳清的ph值至4~6，使乳蛋白析出；（3）采用离心去除乳蛋白得到酸性乳清；（4）对所述的酸性乳清进行微滤，所得滤液经切向流浓缩得到酸性浓缩乳清；（5）采用碱性物质调节所述的酸性浓缩乳清的ph值至6.5~7.5，得到中性乳清；（6）采用分子排阻色谱柱对所述的中性乳清进行分离纯化得到外泌体粗提液；（7）采用密度梯度离心对所述的外泌体粗提液进行分离纯化，收集外泌体梯度层；（8）对所述的外泌体梯度层进行离心，收集沉淀，即为所述的乳源外泌体。
28.优选地，所述的步骤（2）中，采用浓度为5mol/l~7mol/l的盐酸水溶液调节所述的乳清的ph值至4.3~4.8。优选地，所述的步骤（5）中，采用浓度为4mol/l~6mol/l的naoh水溶液调节所述的酸性浓缩乳清的ph值至6.8~7.2。
29.优选地，所述的步骤（1）中，先将乳液在第一离心力下进行第一级离心，然后将第一级离心得到的乳清在第二离心力下进行第二级离心，收集第二级离心得到的乳清，其中，作为优选，所述的第一离心力为5000g~7000g，所述的第二离心力为1500g~2500g，所述的第一级离心和所述的第二级离心的时间分别为5min~30min。
30.优选地，所述的步骤（3）中采用的离心力为4500g~6500g，离心时间为20min~40min。
31.优选地，所述的步骤（7）中密度梯度离心的离心力为100000g~200000g，离心时间为5h~20h。
32.优选地，所述的步骤（8）采用的离心力为100000g~120000g，离心的时间为1h~2h。
33.优选地，所述的乳源外泌体的制备方法中所有的离心均在0℃~8℃下进行。
34.优选地，所述的步骤（4）中，所述的微滤包括对所述的酸性乳清进行第一级微滤得到初级截留液，对所述的初级截留液进行第二级微滤得到二级截留液，对所述的二级截留液进行第三级微滤得到用于浓缩的滤液，其中：第一级微滤采用的滤膜的孔径为0.5μm~0.8μm，第二级微滤采用的滤膜的孔径为0.3μm~0.5μm，第三级微滤采用的滤膜的孔径为0.2μm~0.25μm。
35.优选地，所述的步骤（4）中，所述的切向流浓缩采用截留分子量为100kda~500kda的中空纤维柱。浓缩的倍数为5~10倍。
36.优选地，所述的步骤（6）中，所述的分子排阻色谱柱的排阻分子量为650 kda ~750kda。
37.优选地，所述的步骤（7）中，所述的密度梯度离心采用的分层液为碘克沙醇溶液或葡萄糖溶液，所述的分层液的质量分数范围为5%~50%，所述的分层液的质量分数自下向上按照5%~15%的梯度递减。优选地，所述的分层液的表面使用pbs缓冲液进行封层。
38.优选地，所述的步骤（8）中收集的沉淀物使用pbs缓冲液、tris缓冲液、hepes缓冲液或无菌无酶水重悬后保存。
39.优选地，羊奶、马奶、骆驼奶或其他物种来源的乳液中的一种或多种。
40.优选地，所述的乳液是其中脂肪的质量百分数为0.001%~5%的乳液。
41.对于乳液的获得没有特别的限制，常温存储销售的巴氏杀菌奶、常温存储销售的高温和超高温杀菌奶、4℃存储销售的巴氏杀菌奶皆可使用，类型包括脱脂奶、半脱脂奶以及全脂奶。
42.根据本发明的优选方案，它们相对而言，有助于在提高外泌体的质量（纯度、浓度、均一性、膜结构完整性等方面）、外泌体的收率中的至少一方面具有更好的效果。
43.本发明还提供由上述乳源外泌体的制备方法制备的乳源外泌体以及上述乳源外泌体在药物递送系统中的应用。
44.由于采用上述技术方案，本发明与现有技术相比具有如下优点：本发明方法获得的外泌体，其纯度和颗粒浓度更高，同时膜结构完整、不变形，相比现有方法制备的外泌体质量更好；此外，本发明的收率高、成本较低。
附图说明
45.图1为实施例1制备的外泌体重悬液的透射电镜图；图2为对比例1制备的外泌体重悬液的透射电镜图；图3为对比例2制备的外泌体重悬液的透射电镜图；图4为实施例3制备的外泌体纯化液的透射电镜图；图5为实施例1制备的外泌体重悬液的外泌体粒径分布图；图6为实施例2制备的外泌体重悬液的外泌体粒径分布图；图7为实施例3制备的外泌体纯化液的外泌体粒径分布图；图8为对比例1制备的外泌体重悬液的外泌体粒径分布图；图9为对比例2制备的外泌体重悬液的外泌体粒径分布图。
具体实施方式
46.以乳源外泌体作为药物体内递送系统具有天然的优势，但是，相比血液等其他来源外泌体，乳源外泌体的提取、纯化的难度明显提高。目前，针对乳源外泌体的制备方法的报道比较少。乳源中含有大量的乳蛋白和脂肪，使得很多在细胞培养上清液中具有很好的效果的纯化方法无法使用。而虽然目前已知一些提取乳源乳蛋白的方法，但是用于乳液外泌体制备工艺时，不可避免对乳源外泌体造成或多或少的损伤，或者对乳源外泌体提取物的后期生物活性有影响，在后续制备过程中，很难兼顾乳源外泌体的纯度和收率。本发明旨在解决前述问题。
47.本发明通过对工艺进行整体设计，特别是其中在对酸性乳清进行浓缩之后、进行后续分离纯化之前，将其ph调节至中性，对于保证后续制备的外泌体囊泡膜的结构完整性和不变形起到了出乎意料的积极作用。本发明进一步将乳蛋白等电点沉淀、切向流浓缩、尺寸排阻、密度梯度离心和超速离心有机结合，不仅获得了结构完整且不变形、纯度高的高质量外泌体，而且收率高。本发明方法有助于实现乳源外泌体的工业化制备，以及为天然乳源外泌体药用价值的挖掘和基于乳源外泌体的药物递送技术开发提供有力支持。
48.术语定义
术语“乳液”，在无特别定义时，是指来源于奶牛、人类、水牛、山羊、绵羊、骆驼、驴、马、驯鹿、驼鹿或牦牛的乳或初乳。
49.术语“乳源外泌体”，是指以乳液为原料，分离获取的外泌体。术语“乳源”可与术语“从乳中分离”互换使用。
50.术语“室温”指环境温度为25
±
5℃。
51.术语“脱脂牛奶”又称全脱脂牛奶，是将正常牛奶中的脂肪去掉一部分，使脂肪含量降到0.5％及以下，并且，几乎除去牛奶中的全部水分并不含任何人工添加剂。
52.术语“乳清”涉及牛奶中的脂肪被除去以及蛋白沉淀并被除去之后剩余的液相。
53.术语“药物递送系统”指递送药物活性成分至期望的身体部位和/或使治疗剂适时释放的制剂。本技术中，乳源外泌体可递送的药物活性成分包括小分子药物或生物治疗剂，所述的生物治疗剂不天然存在于乳源外泌体中，所述的生物治疗剂选自肽、蛋白质、多糖或核酸，所述的核酸选自单链或双链dna、irna、sirna、shrna、mrna、非编码rna(ncrna)、反义rna、lna、吗啉代寡核苷酸或其类似物或缀合物。
54.术语“分离纯化”是指包含感兴趣的分析物的试验样品和干扰物质彼此物理隔离或分开。
55.术语“离心力”是指将旋转体拉离旋转中心的表观向外力。所述方法优选地为机械方法，更优选地通过在旋转装置诸如离心机中施加离心力来进行。
56.术语“膜”表示半渗透材料，其可以用于将供给流体中的组分分离成穿过材料的渗透物和被材料截留的保留物。
57.术语“密度梯度离心(density gradient centrifugation)”指用一定的介质在离心管内形成连续或不连续的密度梯度，将包含感兴趣的分析物的试验样品与底层混合，通过离心力场的作用使感兴趣的分析物分层、分离。
58.术语“清洗液”是指从色谱柱或色谱膜释放出的流体。
59.下面结合具体的实施案例对本发明的技术方案进一步描述，但本发明不只限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体要求做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。以下实施例和对比例仅以牛奶为例，其他乳源，例如羊奶等，同样适用于上述制备方法。
60.本发明中，如无特殊说明，使用的仪器、原料和试剂均可通过市售获得。本发明中，使用的离心机为低温离心机。以下实施例和对比例中使用的牛奶具体为德悠牌脱脂纯牛奶，常温保存。
61.实施例1本实施例提供一种牛奶外泌体的制备方法，其具体步骤如下：s1. 取50ml牛奶，4℃、6000g离心10min，收集中间层乳清a。
62.s2. 乳清a于4℃、2000g离心20min，收集中间层乳清b。
63.s3. 乳清b用6mol/l的hcl水溶液调ph值至4.60，室温静置10min，析出乳蛋白。
64.s4. 于4℃、5000g离心30min，去除乳蛋白，收集中间层，得到乳清c（酸性乳清）。
65.s5. 乳清c经0.8μm滤膜过滤，收集滤液，得到乳清d。
66.s6. 乳清d经0.45μm滤膜过滤，收集滤液，得到乳清e。
67.s7. 乳清e经0.22μm滤膜过滤，收集滤液，得到乳清f。
68.s8. 乳清f经100kda中空纤维柱进行切向流过滤浓缩，浓缩倍数为6.73倍，收集浓缩乳清g（酸性浓缩乳清）。
69.s9. 乳清g用4mol/l的naoh水溶液调ph值至7.0，得到中性乳清h。
70.s10. 将5ml中性乳清h通过排阻分子量为700kda的分子排阻色谱柱（cytiva capto core 700 be-sec柱），柱填料体积为10ml，中性乳清h过柱完毕后，使用1ml的1
×
pbs进行过柱清洗，清洗液与过柱后的浓缩乳清进行合并，得到牛奶外泌体粗提液。
71.s11. 将5.2ml的牛奶外泌体粗提液与10.6ml的60%碘克沙醇溶液混合成40%碘克沙醇底层液，转移至直立的离心管中，约占离心体系的40%。在40%碘克沙醇底层液上方依次逐步添加5.85ml的30%碘克沙醇稀释液、5.85ml的20%碘克沙醇稀释液、5.85ml的10%碘克沙醇稀释液，最后以5.85ml的1
×
pbs缓冲液封在最上层液面上方，完成密度梯度离心体系的制备。
72.s12. 在4℃、186000g条件下离心18h，使牛奶外泌体与牛奶外泌体粗提液中的其它成分分离。
73.s13. 将迁移至10%碘克沙醇稀释液和20%碘克沙醇稀释液界面处的牛奶外泌体梯度层小心抽取出来，体积约为6ml。
74.s14. 用1
×
pbs缓冲液将抽取出来的牛奶外泌体梯度液稀释，再以4℃、110000 g离心90 min，离心完毕，将贴于管壁底部的外泌体沉淀用200μl 1
×
pbs缓冲液重悬，置于4℃保存。
75.实施例2本实施例提供一种牛奶外泌体的制备方法，其具体步骤如下：s1. 取50ml牛奶，4℃、6000g离心10min，收集中间层乳清a。
76.s2. 乳清a于4℃、2000g离心20min，收集中间层乳清b。
77.s3. 乳清b用6mol/l的hcl水溶液调ph值至4.60，室温静置10min，析出乳蛋白。
78.s4. 于4℃、5000g离心30min，收集中间层乳清c（酸性乳清）。
79.s5. 乳清c用0.8μm滤膜过滤，收集滤液，得到乳清d。
80.s6. 乳清d用0.45μm滤膜过滤，收集滤液，得到乳清e。
81.s7. 乳清e用0.22μm滤膜过滤，收集滤液，得到乳清f。
82.s8. 乳清f经100kda中空纤维柱进行切向流过滤浓缩，浓缩倍数为6.73倍，收集乳清g（酸性浓缩乳清）。
83.s9. 乳清g用4mol/l的naoh水溶液调ph值至7.0，得到中性乳清h。
84.s10. 将5.2ml的中性乳清h与10.6 ml的60%碘克沙醇溶液混合成40%碘克沙醇底层液，转移至直立的离心管中，约占离心体系的40%。在40%碘克沙醇底层液上方依次逐步添加5.85ml的30%碘克沙醇稀释液、5.85ml的20%碘克沙醇稀释液、5.85ml的10%碘克沙醇稀释液，最后以5.85ml的1
×
pbs缓冲液封在最上层液面上方，完成密度梯度离心体系的制备。
85.s11. 以4℃、186000g离心18h，使牛奶外泌体与中性乳清h中的其它成分分离。
86.s12. 将迁移至10%碘克沙醇稀释液和20%碘克沙醇稀释液界面处的牛奶外泌体梯度层小心抽取出来。
87.s13. 将牛奶外泌体梯度层溶液通过排阻分子量为700kda的分子排阻色谱柱（cytiva capto core 700 be-sec柱）柱进行外泌体纯化，柱填料体积为10ml，中性浓缩乳
清h过柱完毕后，使用1ml的1
×
pbs缓冲液进行过柱清洗，清洗液与过柱后的浓缩乳清进行合并，得到牛奶外泌体纯化液。
88.s14. 将纯化液以4℃、110000g离心90min，离心完毕，将贴于管壁底部的外泌体沉淀用200μl 1
×
pbs重悬，置于4℃保存。
89.实施例3本实施例提供一种牛奶外泌体的制备方法，其具体步骤如下：s1. 取50ml牛奶，4℃、6000g离心10min，收集中间层乳清a。
90.s2. 乳清a于4℃、2000g离心20min，收集中间层乳清b。
91.s3. 乳清b用6mol/l的hcl水溶液调ph值至4.60，室温静置10min，析出乳蛋白。
92.s4. 于4℃、5000g离心30min，收集中间层乳清c（酸性乳清）。
93.s5. 乳清c用0.8μm滤膜过滤，收集滤液，得到乳清d。
94.s6. 乳清d用0.45μm滤膜过滤，收集滤液，得到乳清e。
95.s7. 乳清e用0.22μm滤膜过滤，收集滤液，得到乳清f。
96.s8. 乳清f经100kda中空纤维柱进行切向流过滤浓缩，浓缩倍数为6.73倍，收集乳清g（酸性浓缩乳清）。
97.s9. 乳清g用4mol/l的naoh水溶液调ph值至7.0，得到中性乳清h。
98.s10. 将5.2ml的中性乳清h与10.6ml的60%碘克沙醇溶液混合成40%碘克沙醇底层液，转移至直立的离心管中，约占离心体系的40%。在40%碘克沙醇底层液上方依次逐步添加5.85ml的30%碘克沙醇稀释液、5.85ml的20%碘克沙醇稀释液、5.85ml的10%碘克沙醇稀释液，最后以5.85ml的1
×
pbs封在最上层液面上方，完成密度梯度离心体系的制备。
99.s11. 以4℃、186000g离心18h，将外泌体与中性乳清h中的其它成分分离。
100.s12. 将迁移至10%碘克沙醇稀释液和20%碘克沙醇稀释液界面处的牛奶外泌体梯度层小心抽取出来，体积约为6ml。
101.s13. 用1
×
pbs缓冲液将牛奶外泌体梯度层溶液进行稀释，再以110000g、4℃下离心90min，离心完毕，将贴于管壁底部的外泌体沉淀用200μl的1
×
pbs缓冲液重悬。
102.s14. 外泌体重悬液通过排阻分子量为700kda的分子排阻色谱柱（cytiva capto core 700 be-sec柱）柱进行外泌体纯化，柱填料体积为2.5ml，梯度层溶液过柱完毕，以0.9ml的1
×
pbs缓冲液洗柱，洗柱液与梯度层过柱纯化液合并为外泌体的sec纯化液，终体积为1.0ml，置于4℃保存。
103.实施例4本实施例提供一种牛奶外泌体的制备方法，其基本同实施例1，不同的是，步骤s9中，调节ph至6.5。
104.实施例5本实施例提供一种牛奶外泌体的制备方法，其基本同实施例1，不同的是，步骤s9中，调节ph至7.5。
105.实施例6本实施例提供一种牛奶外泌体的制备方法，其基本同实施例1，不同的是，只进行一级滤膜过滤，滤膜孔径为0.45μm。
106.对比例1
本对比例提供一种牛奶外泌体的制备方法，其具体步骤如下：s1. 取50ml牛奶，4℃、6000g离心10min，收集中间层乳清a。
107.s2. 乳清a于4℃、2000g离心20min，收集中间层乳清b。
108.s3. 乳清b用6mol/l的hcl水溶液调ph值至4.60，室温静置10min得到酸性乳清。
109.s4. 酸性乳清于4℃、5000g离心30min，收集中间层乳清c。
110.s5. 乳清c用0.8μm滤膜过滤，收集初过滤乳清d。
111.s6. 初过滤乳清d用0.45μm滤膜过滤，收集次过滤乳清e。
112.s7. 次过滤乳清e用0.22μm滤膜过滤，收集终过滤乳清f。
113.s8. 终过滤乳清f经100kda中空纤维柱进行切向流过滤浓缩，浓缩倍数为6.73倍，收集浓缩乳清g。
114.s9. 将5.2ml的浓缩乳清g与10.6ml的60%碘克沙醇溶液混合成40%的碘克沙醇底层液，转移至直立的离心管中，约占离心体系的40%。在40%的碘克沙醇底层液上方依次逐步添加5.85ml的30%碘克沙醇稀释液、5.85ml的20%碘克沙醇稀释液、5.85ml的10%碘克沙醇稀释液，最后以5.85ml的1
×
pbs封在最上层液面上方，完成密度梯度离心体系的制备。
115.s10. 以4℃、186000g离心18h，将外泌体与浓缩乳清g中的其它成分分离。
116.s11. 将迁移至10%碘克沙醇稀释液和20%碘克沙醇稀释液之间的牛奶外泌体梯度层小心抽取出来，体积约为6ml，用1
×
pbs将抽取出来的牛奶外泌体梯度液稀释，再以110000 g、4℃下离心90min。
117.s12. 离心完毕，将贴于管壁底部的外泌体沉淀用200μl 1
×
pbs重悬，置于4℃保存。
118.对比例2本对比例提供一种牛奶外泌体的制备方法，其基本同实施例1，不同的是，省略其中的s9步骤。
119.外泌体鉴定实验通过不同检测指标对所提取的外泌体进行鉴定，其中通过透射电子显微镜（tem）观察所提取的外泌体膜结构是否完整、大小是否符合预期；通过纳米颗粒跟踪技术(nta)对外泌体的粒径和颗粒数浓度进行分析，根据每毫升乳液所能提取到的外泌体颗粒数评估外泌体提取效率；通过bca法检测蛋白浓度，根据单位蛋白的外泌体颗粒数（外泌体颗粒浓度与蛋白浓度的比值）来评估外泌体的纯度，比值越大说明纯度越高。
120.通过透射电子显微镜（tem）观察实施例、对比例最终获得的外泌体重悬液或纯化液中的外泌体情况，其中实施例制备的外泌体的结构相比于对比例，明显更加完整、无变形。对比图1~图4可见，在相同的放大倍数下，实施例1制备的外泌体重悬液中观察到的外泌体膜结构完整、无变形（呈“杯盘”结构的典型囊泡），大小更符合预期，外泌体数量更多，同时，背景杂质明显更少；对比例2制备的外泌体重悬液中观察到的未变形的外泌体的数量明显降低；对比例1制备的外泌体重悬液中观察到的未变形的外泌体的数量极少，背景杂质更多。在实施例1、2、3这三个实施例中，实施例1制备的外泌体重悬液中观察到的典型囊泡数量最多，结构最为完整，杂质最少，明显优于实施例2和实施例3。
121.通过纳米颗粒跟踪技术（nta）对上述各例制备的外泌体重悬液或纯化液中的颗粒粒径和颗粒数浓度进行分析，结果如图5至图9所示，结果表明：实施例1制备的外泌体的粒
径分布窄，峰值粒径140.9nm，平均粒径为159.1nm，均一性好，外泌体颗粒数浓度为4.64e+11（颗粒数/ml），明显优于其他实施例和对比例。
122.根据bca蛋白定量法检测各例制备的外泌体重悬液或纯化液中残留的蛋白的浓度，并按照外泌体颗粒数浓度/蛋白浓度来计算单位蛋白的外泌体颗粒数目，结果参见表1。
123.此外，根据上述各例制备方法制备的外泌体重悬液或纯化液中的外泌体颗粒数浓度计算每毫升牛奶的外泌体获得量，结果如表1所示。
124.表1显示，实施例1的外泌体浓度和纯度最好。虽然表1显示对比例1和对比例2的外泌体重悬液中外泌体颗粒浓度及每毫升牛奶的外泌体的获得量也比较高，但是结合透射电镜结果可知，对比例1和对比例2制备的外泌体，其中变形的外泌体的数量居多，未变形的外泌体颗粒数浓度实际要远远小于表1中的数据。
125.以上对本发明做了详尽的描述，目的在于让本领域内的技术人员了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，且本发明不限于上述的实施例，凡根据本发明的精神实质所做的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。