甜瓜单性花A基因CmACS7的分子标记及其应用

本发明属于分子标记辅助育种，具体涉及甜瓜单性花a基因cmacs7的分子标记及其应用。

背景技术：

1、常规育种年限长、效率低且成本高，分子标记反映生物个体基因组dna片段的差异，直接反映种质资源本质，具有高效、准确及经济等优点，可大幅缩短育种周期，是传统育种技术的重要补充(sousaraeiet al.,2018)。snp分子标记具有数量多、遗传稳定等优点，基于酶切扩增多态性序列标记技术(caps)的snp分子标记检测方法(tzurietal.,2015；liet al.,2017)，主要是将pcr扩增产物中含snp位点的dna片段进行限制性酶切分析，是snp分子标记的检测方法之一(杨旭辉等,2018)。

2、甜瓜(cucumismelo l.)属于葫芦科(cucurbitaceae)甜瓜属(cucumis)蔓生草本植物，品质风味独特，是餐后的最佳果品之一。大多数甜瓜品种为雄全同株类型(雄花、完全花同株)，即植株上有单性的雄花和两性花，其中能结果的是两性花。两性花本身有雄蕊也有雌蕊，要获得高纯度的杂交一代种子，必须人工去除两性花中的雄蕊，以其它品种的花粉为其人工授粉，但是授粉过程耗费大量的人力物力，而且对甜瓜的品质及产量都产生重大影响。甜瓜作为高产高效的重要经济作物之一，利用雌性系育种一直是保护地栽培用种主要的育种目标之一。在制种过程中省去了人工授粉过程，不仅能够高产优质，而且还能节约成本。

3、目前，有关瓜类单性雌花分子标记的研究报道比较多，研究表明甜瓜单性雌花由显性单基因a控制，并证实雄花两性花是由于单核苷酸的突变产生a57v的替换，造成cmacs-7编码的乙烯生物合成酶的位点改变，因此产生两性花。基因cmacs-7中a57v的突变产生alu1酶切位点，基于酶切位点设计开发的caps标记可以区分单性雌花与两性花，但不能区分纯合与杂合的单性雌花，而且该标记需要酶切，耗时而且成本高。此外，研究人员还基于genbank中公开的序列(登录号eu791279)设计4对引物来克隆“rh107”和“76-09”上的cmacs-7基因，开发与cmacs-7基因紧密相连的共显性indel标记，得到一对特异性引物tl-l/tl-r(feng et al.,2009)，但该标记仍无法区分单性雌花与两性花，且距离cmacs-7有一定的遗传距离，产生偏差。综上可知，现有的甜瓜单性雌花检测效率不高，准确度不高，因此，研究甜瓜性别遗传规律及产生机理对指导甜瓜育种实践具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的主要目的是提供甜瓜单性花a基因cmacs7的分子标记，可以快速、准确地区分甜瓜性别，解决现有技术鉴定甜瓜性别的过程繁琐、准确率低和速度慢的技术问题。

2、本发明的另一目的是提供上述甜瓜单性花a基因cmacs7的分子标记在甜瓜定向性别育种中的应用。

3、本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：

4、本发明提供甜瓜单性花a基因cmacs7的分子标记，其包含序列如seq id no:1-3所示的3条标记特异引物和序列如seq id no:4和seq id no:5所示的2条荧光通用引物，如下表所示：

5、

6、本发明还提供一种鉴定甜瓜性别的试剂盒，所述试剂盒包含上述甜瓜单性花a基因cmacs7的分子标记，其组成包括master mix和primer mix的混合物，其中：

7、所述master mix包含如seq id no:4和seq id no:5所示的荧光通用引物、聚合酶、dntps和mgcl2，且预置于优化的缓冲液中；

8、所述primer mix包含如seq id no:1-3所示的标记特异引物。

9、本发明还提供一种确定甜瓜基因型的方法，所述方法包括以下步骤：

10、(1)提取待检测甜瓜的dna；

11、(2)采用fret+2×master mix对设计的引物进行实时荧光定量pcr检测，对扩增产物进行全波段荧光扫描获得snp分型，其中：

12、如果snp分型的颜色为fam探针的颜色(红色)，则待检测甜瓜的基因型为aa型；

13、如果snp分型的颜色为hex探针的颜色(蓝色)，则待检测甜瓜的基因型为aa型；

14、如果snp分型的颜色为绿色，则待检测甜瓜的基因型为aa型。

15、作为优选，步骤(2)中，所述实时荧光定量pcr的反应体系为：

16、 <![cdata[fret⁺2×master mix]]> 5ul primer mix 0.55ul gdna 1ul <![cdata[ddh₂o]]> to 10ul

17、作为优选，步骤(2)中，所述实时荧光定量pcr的反应程序为：

18、 程序 温度 预变性 95℃ 变性 95℃ 退火/延伸 65℃

19、本发明还提供一种鉴定甜瓜性别的方法，所述方法是利用上述甜瓜单性花a基因cmacs7的分子标记鉴定待检测甜瓜的cmacs7基因型，根据cmacs7基因型决定甜瓜的性别，其中：

20、cmacs7基因型如果是aa型，则待检测甜瓜为雌雄异花同株；

21、cmacs7基因型如果是aa型，则待检测甜瓜为雄全同株。

22、本发明还提供上述甜瓜单性花a基因cmacs7的分子标记或上述鉴定甜瓜性别的试剂盒在培育甜瓜雌性或雄性性别中的应用。

23、本发明还提供上述确定甜瓜基因型的方法或上述鉴定甜瓜性别的方法在甜瓜定向性别育种中的应用。

24、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

25、荧光共振能量转移(fret)是距离很近的两个荧光分子间产生的一种非放射性的能量转移现象，本发明利用fret+基因分型技术根据目标基因的关键变异位点设计引物，利用引物末端碱基的特异匹配对目标基因进行snp分型，可以在广泛的基因组dna样本包括一些具有复杂基因组的dna样本中对snp和特定位点上的indels进行准确的基因分型。本发明基于甜瓜雌性cmacs7基因序列设计高通量检测的分子标记应用于甜瓜雌性系基因转育，操作流程全自动，降低人为误差，分析通量高，兼容96、384多孔板，每天可完成数万个snp基因分型，非常适合大量样品同时检测，可以大大节约时间和人工成本，提高分子标记辅助选择的育种效率，加速甜瓜雌性性状向优异骨干自交系的转育。